Programmierbare Proteinabgabe mit einem bakteriellen kontraktilen Injektionssystem

Nov 11, 2023

Nature Band 616, Seiten 357–364 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Endosymbiotische Bakterien haben komplizierte Transportsysteme entwickelt, die es diesen Organismen ermöglichen, mit der Wirtsbiologie in Kontakt zu treten. Ein Beispiel sind die extrazellulären kontraktilen Injektionssysteme (eCISs), bei denen es sich um spritzenartige makromolekulare Komplexe handelt, die Proteinnutzlasten in eukaryontische Zellen injizieren, indem sie einen Dorn durch die Zellmembran treiben. Kürzlich wurde festgestellt, dass eCISs auf Mauszellen abzielen1,2,3, was die Möglichkeit erhöht, dass diese Systeme für die therapeutische Proteinabgabe genutzt werden könnten. Ob eCISs in menschlichen Zellen funktionieren können, ist jedoch noch unbekannt, und der Mechanismus, durch den diese Systeme Zielzellen erkennen, ist kaum verstanden. Hier zeigen wir, dass die Zielauswahl durch die Photorhabdus-Virulenzkassette (PVC) – ein eCIS des entomopathogenen Bakteriums Photorhabdus asymbiotica – durch die spezifische Erkennung eines Zielrezeptors durch ein distales Bindungselement der PVC-Schwanzfaser vermittelt wird. Darüber hinaus zeigen wir mithilfe der strukturgesteuerten In-silico-Technik der Schwanzfaser, dass PVCs so umprogrammiert werden können, dass sie Organismen angreifen, die von diesen Systemen ursprünglich nicht angegriffen werden – einschließlich menschlicher Zellen und Mäuse –, und zwar mit einer Effizienz von nahezu 100 %. Schließlich zeigen wir, dass PVCs verschiedene Proteinnutzlasten, einschließlich Cas9, Baseneditoren und Toxine, laden und diese funktionell in menschliche Zellen transportieren können. Unsere Ergebnisse zeigen, dass PVCs programmierbare Proteinabgabegeräte mit möglichen Anwendungen in der Gentherapie, Krebstherapie und Biokontrolle sind.

Für endosymbiotische Bakterien ist es oft von Vorteil, Faktoren abzusondern, die die Wirtsbiologie zugunsten der Symbiontenfitness modulieren4. Viele dieser Faktoren können jedoch die Zellmembranen nicht ohne weiteres passieren; Dies hat zur Entwicklung komplexer Systeme geführt, die aktiv Nutzproteine ​​in Zellen transportieren5. Ein Beispiel sind die kontraktilen Injektionssysteme (CIS), eine Klasse spritzenartiger Nanomaschinen, die Bakteriophagenschwänzen ähneln6,7.

CISs sind makromolekulare Komplexe, die eine starre Röhrenstruktur enthalten, die in einer kontraktilen Hülle untergebracht ist, die an einer Grundplatte verankert und durch ein Spike-Protein geschärft wird8,9,10,11,12,13,14. Es wird angenommen, dass Nutzlasten in das Lumen des Innenrohrs hinter dem Dorn geladen werden, Fusionsproteine ​​mit dem Rohr bilden oder sich mit dem Dorn selbst verbinden, der – bei Erkennung der Zielzelle – durch Kontraktion der Hülle durch die Membran gedrückt wird2,3,15, 16,17. Diese Strategie hat sich in der gesamten Biosphäre als bemerkenswert erfolgreich erwiesen, da CIS nachweislich auf Organismen aus allen drei Lebensbereichen abzielen12,18,19. CIS können an der Bakterienmembran verankert werden, was zu einem kontaktabhängigen Abgabesystem führt, das als Typ-VI-Sekretionssystem8,20 (T6SS) bekannt ist, oder sie können bei Cyanobakterien an der Thylakoidmembran befestigt werden (tCIS), um bei zellulärem Stress aktiviert zu werden Antwort13; Schließlich können sie als freie Komplexe (eCISs) produziert und extrazellulär freigesetzt werden, um Nutzlasten unabhängig vom Bakterienproduzenten zu liefern21,22,23,24. eCIS sind in Bakterien und Archaeen weit verbreitet und gruppieren sich nachweislich in mindestens sechs Unterfamilien, von denen nur zwei charakterisierte Beispiele enthalten21,22,23. Es wurde gezeigt, dass eCIS-Nutzlasten eine Vielzahl natürlicher Funktionen aufweisen, darunter die Modulation des Zytoskeletts des Wirts18,24, die DNA-Spaltung1, die Induktion von Metamorphose15,25 und die Toxizität des Wirts22,24,26, was darauf hinweist, dass diese Systeme für mehrere biologische Nischen angepasst wurden. Kürzlich wurde festgestellt, dass eCISs auf Mauszellen abzielen1,2,3, was die Möglichkeit erhöht, dass diese Systeme als Werkzeuge zur Proteinabgabe genutzt werden könnten. Allerdings muss die eCIS-Aktivität in menschlichen Zellen noch nachgewiesen werden, und der Mechanismus, durch den eCIS Zielzellen erkennen – eine Notwendigkeit, wenn diese Systeme zu gezielten Abgabegeräten entwickelt werden sollen – muss noch geklärt werden.

Für unsere Studien zur eCIS-Aktivität haben wir uns auf einen Subtyp von eCISs konzentriert: die PVCs. PVCs sind eCISs, die von Mitgliedern der Gattung Photorhabdus produziert werden und als Endosymbionten innerhalb entomopathogener Nematoden existieren24. PVCs bestehen aus einem Operon von etwa 20 kb, das 16 Kerngene (pvc1–16) enthält, die für den Aufbau eines funktionellen Injektionssystems erforderlich sind (Abb. 1a). Unmittelbar stromabwärts von pvc1–16 befinden sich die Nutzlasten Pdp1 und Pnf, von denen angenommen wird, dass sie – wie bei allen eCISs – durch Kontraktion der PVC-Hülle und anschließende Zerlegung des Spike-Röhren-Komplexes in die Zielzellen gelangen (Abb. 1b).

a, Schematische Darstellung des PVCpnf-Locus von P. asymbiotica, der 16 Struktur- und akzessorische Gene (in Blau bzw. Violett) enthält, gefolgt von zwei Nutzlastgenen (Pdp1 und Pnf, in Rot) und vier mutmaßlichen regulatorischen Genen (in Orange). PVC-Abbildungen sind Näherungswerte und nicht maßstabsgetreu. b, Vorgeschlagener Mechanismus der PVC-vermittelten Proteinabgabe. PVCs erkennen Zielzellen wahrscheinlich über Schwanzfasern (Pvc13), was zu einer Kontraktion des Hüllenmechanismus führt, der eine Spitze durch die Zellmembran treibt. Es wird dann angenommen, dass Nutzproteine ​​durch die Zerlegung des Spike-Röhren-Komplexes in die Zelle gelangen. c, PVCs können aus E. coli gereinigt werden. Der PVCpnf-Locus wurde in E. coli transformiert und intakte PVC-Partikel wurden isoliert. Die resultierenden PVC-Präparate wurden dann auf einem denaturierenden SDS-PAGE-Gel laufen gelassen und mit Negativfärbungs-TEM abgebildet. Maßstabsbalken, 100 nm. d, PVCs können sichtbar gemacht werden, indem sie an Zielzellen binden. PVC-Partikel, die Epitop-markierte Hüllproteine ​​(Pvc2) enthielten, wurden mit Sf9-Zellen inkubiert und die Bindung wurde mittels Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. Maßstabsbalken, 100 μm. e, Nicht-native Nutzlasten können in PVC-Partikel geladen werden. Die Pdp1-Verpackungsdomäne (PD) (Extended Data Abb. 3b, c) wurde mit neuen Proteinen fusioniert und die Beladung wurde mittels denaturierendem Western Blot bestimmt. Als Belastungskontrolle diente PVC12 (Grundplatte). WT, Wildtyp. f, Wildtyp-PVC-Partikel töten kultivierte Insektenzellen. PVC-vermittelte Zytotoxizität erforderte sowohl die Wirkung des mutmaßlichen Zielerkennungsgens (pvc13; Schwanzfaser) als auch des Nutzlastladers (pvc15; ATPase). Maßstabsbalken, 200 μm. g: PVCs können eine nicht-native Nutzlast (geladen wie in e) in Zielzellen liefern. Maßstabsbalken, 200 μm. Die Daten in f,g sind Mittelwerte ± Standardabweichung mit n = 3 biologischen Replikaten; einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test. ****P < 0,0001.

Quelldaten

Wir haben zunächst Escherichia coli entwickelt, um PVCs aus P. asymbiotica ATCC 43949 (PVCpnf) (Extended Data Abb. 1a) herzustellen, und zwar mit einer Methode, die der zuvor beschriebenen ähnelt9. Um die nachgelagerte Manipulation zu erleichtern, teilen wir das PVC-System in separate Struktur- und Zubehörplasmide (pPVC) sowie Nutzlast- und Regulierungsplasmide (pPayload) auf. Bei der Untersuchung mittels Negativfärbungs-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ähnelten die resultierenden Proteinkomplexe kanonischen eCISs, die intakte Grundplatten und Hüllenstrukturen mit einer Länge von etwa 116 nm enthielten (Abb. 1c und Extended Data Abb. 1b). Wir beobachteten, dass pPayload notwendig war, um nachweisbare PVC-Partikel zu produzieren (Extended Data Abb. 1c – h), was darauf hindeutet, dass kleine Gene in der Payload-Region (in Abb. 1a orange markiert und an anderer Stelle vermutet, dass sie an der Genregulation beteiligt sind) von entscheidender Bedeutung sind Bildung von PVCs in E. coli. Schließlich fanden wir auch heraus, dass diese gereinigten Komplexe, wenn sie kurzzeitig kultivierten Sf9-Insektenzellen ausgesetzt wurden (ausgewählt aufgrund der Beziehung dieser Zelllinie zu dem Insekt, auf das PVCpnf24 endogen abzielt), robust an die Zelloberfläche binden (Abb. 1d und Extended Data Abb . 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass E. coli zur Herstellung von PVC-Komplexen verwendet werden kann, die sowohl eine ordnungsgemäße Assemblierung als auch ein korrektes Targeting aufweisen.

Um PVCs zu programmierbaren Proteinabgabegeräten zu entwickeln, haben wir als nächstes versucht, neuartige, nicht native Nutzlasten in das PVC zu laden (Abb. 1e und erweiterte Daten Abb. 3a). Obwohl der Mechanismus, durch den PVCs Nutzlasten rekrutieren, nicht vollständig geklärt ist, wurde kürzlich gezeigt, dass stark ungeordnete Regionen an den N-Termini endogener PVC-Nutzlastproteine ​​(Extended Data Abb. 3b) am Ladeprozess beteiligt sind3. Wir haben bestätigt, dass modifizierte Nutzlasten, denen diese ungeordnete Region fehlt, nicht in PVCs geladen wurden (Extended Data Abb. 3c, d), was darauf hinweist, dass diese Region eine „Verpackungsdomäne“ darstellt, die zum Laden einer Nutzlast in den PVC-Komplex erforderlich ist. Daher fusionierten wir diese Verpackungsdomäne mit verschiedenen Proteinen, die nicht auf natürliche Weise in das PVC geladen werden (GFP, Cre und eine Zinkfinger-Nuklease) und testeten, ob die resultierenden manipulierten Nutzlasten in die PVCs geladen wurden (Abb. 1e). Wir fanden heraus, dass in Gegenwart von pvc15 (einer ATPase, die nachweislich auch für das Laden der Nutzlast notwendig ist3) alle drei neuartigen Nutzlasten gemeinsam mit den PVCs gereinigt wurden, was bestätigt, dass diese Methode (N-terminale Fusion einer Verpackungsdomäne) eine verallgemeinerbare Strategie ist zum Laden neuartiger Proteine ​​in PVC-Partikel.

Schließlich haben wir getestet, ob die PVC-vermittelte Proteinabgabe – sowohl mit endogenen als auch mit manipulierten Nutzlasten – direkt in kultivierten Insektenzellen beobachtet werden kann. Nach der Inkubation von Sf9-Zellen mit unmodifizierten PVCs, die native Toxin-Nutzlasten enthielten, beobachteten wir eine robuste Zytotoxizität (Abb. 1f). Insbesondere stellten wir fest, dass dieser Phänotyp das Vorhandensein mehrerer kritischer PVC-Gene erforderte, darunter das unserer Hypothese nach zielende Element des PVC (pvc13, das die Schwanzfaser kodiert) und ein Gen, das zuvor als Payload-Loader3 (pvc15) vermutet wurde. Darüber hinaus reichte die Verabreichung separat gereinigter Nutzlasten oder unbeladener PVC-Komplexe nicht aus, um diesen Phänotyp zu reproduzieren (Extended Data Abb. 4a,b), was darauf hindeutet, dass die beobachtete Aktivität die Wirkung sowohl des PVC-Komplexes als auch der Toxin-Nutzlasten erforderte. Darüber hinaus erzeugten mit Cre künstlich beladene PVCs (unter Verwendung der in Abb. 1e beschriebenen Methode) bei Verabreichung an Sf9-Zellen, die ein Cre-Reportersystem (loxP-GFP) enthielten, ein GFP-Signal (Abb. 1g und erweiterte Daten Abb. 4c), was dies zeigt Eine neuartige Proteinnutzlast kann funktionell über das PVC transportiert werden. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass rekombinante PVCs biologisch aktiv gegen kultivierte Insektenzellen sind und umprogrammiert werden können, um nicht-native Proteine ​​sowohl in Zielzellen zu laden als auch abzugeben, um neue biologische Aktivitäten zu erzielen.

Der Mechanismus, durch den PVCs an Zielzellen binden, ist nicht bekannt. Allerdings ist die Zielerkennung durch kontraktile Schwanzphagen (die PVCs ähneln) gut verstanden. Phagen T4 besitzt sechs lange Schwanzfasern, die vom Grundplattenkomplex ausgehen und reversible Wechselwirkungen mit Lipopolysaccharidmolekülen oder Außenmembranproteinen auf der Oberfläche von Wirtszellen eingehen27,28,29. Dieser Prozess positioniert den Phagen in der richtigen Ausrichtung über der Zielzelle und ermöglicht es der Grundplatte, sich nahe genug an die Oberfläche der Zelle zu bewegen, um irreversibel zu binden und die Injektion des Phagengenoms in die Zelle einzuleiten29,30. Eine Reihe von Studien hat gezeigt, dass Modifikationen an den Schwanzfasern von Phagen und anderen auf Bakterien gerichteten CISs ausreichen, um die Zielspezifität auf vorhersehbare Weise zu verändern31,32,33,34, was darauf hinweist, dass diese Proteine ​​wichtige Determinanten der Zielspezifität in diesen Systemen sind. Obwohl derzeit nicht bekannt ist, wie PVCs und andere eCISs auf Zellen abzielen und den Injektionsprozess initiieren, haben wir vorgeschlagen, dass es möglich sein könnte, die PVC-Zielspezifität mithilfe einer ähnlichen Technik zu ändern. Insbesondere enthalten PVC-Loci ein Schwanzfasergen (pvc13), das eine vorhergesagte Domäne besitzt, die der Rezeptorbindungsspitze der kurzen Schwanzfaser des Phagen T4 ähnelt (Extended Data, Abb. 5a). Bemerkenswerterweise unterscheiden sich PVC-Schwanzfasern von Phagenschwanzfasern darin, dass sie häufig auch Regionen enthalten, die auf rezeptorbindende Proteine ​​von eukaryotischen Viren (insbesondere denen von Adenoviren) abgebildet werden, was die Hypothese stützt, dass die PVC-Schwanzfasern an der Erkennung von a beteiligt sind eukaryontischer Organismus. Es wurde auch gezeigt, dass sich PVC-Schwanzfasern mit der Grundplatte verbinden und sich entlang der Hülle nach oben falten, ähnlich wie bei Phagen9. Insgesamt deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass die Schwanzfaser wahrscheinlich an der Zielerkennung beteiligt ist und zur Manipulation der Zielspezifität von PVCs genutzt werden könnte.

Wir haben getestet, ob Modifikationen am PVC-Schwanzfaserprotein (Pvc13) Veränderungen des Tropismus hervorrufen und das Targeting menschlicher Zellen ermöglichen können. Wir haben AlphaFold35,36,37 verwendet, um die 3D-Struktur der mutmaßlichen distalen Spitze von Pvc13 vorherzusagen – der Region, von der wir vorhergesagt hatten, dass sie den ersten Kontakt mit Zielzellen herstellen würde (Abb. 2a und erweiterte Daten Abb. 5b – d). Bei der Abfrage als Trimer bildet der C-Terminus von Pvc13 eine vorhergesagte helikale Röhrenstruktur mit einer kugelförmigen Spitze, von der wir glauben, dass sie die Bindungsdomäne der gesamten Schwanzfaser ist. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine Änderung der Bindungseigenschaften dieser distalen Bindungsdomäne zu vorhersehbaren Änderungen des PVC-Tropismus führen könnte, wie dies bei Schwanzfasern aus anderen CIS der Fall ist. Um dies zu testen, fügten wir eine neue Bindungsdomäne ein, die spezifisch für menschliche Zellen ist (die trimere Knob-Domäne des menschlichen Adenovirus 5 (Ad5)38 oder das für den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) spezifisch gestaltete Ankyrin-Repeat-Protein (DARPin) E0139) in das mutmaßliche Protein C-terminale Bindungsregion von Pvc13 (zur Erzeugung von Pvc13–Ad5-knob bzw. Pvc13–E01-DARPin) und getestet, ob die resultierenden PVCs auf menschliche Zellen abzielen können. Für dieses Experiment verwendeten wir menschliche A549-Adenokarzinomzellen der Lunge als Modellzelllinie, da diese bekanntermaßen EGFR überexprimieren und empfindlich auf eine Ad5-Infektion reagieren. Wir fanden heraus, dass PVCs, die mit Pvc13-Ad5-knob oder Pvc13-E01-DARPin ausgestattet sind, A549-Zellen effizient töteten, wenn sie mit den nativen Toxinen Pdp1 und Pnf beladen wurden (Abb. 2a und Extended Data Abb. 6a – d) oder eine effiziente Cre-gesteuerte GFP-Expression erzeugten in A549 loxP-GFP-Zellen, wenn sie mit Pdp1-NTD-Cre (der an Cre gebundenen N-terminalen Domäne (NTD) von Pdp1) beladen sind, wie in Abb. 1e (Abb. 2a) beschrieben. Bemerkenswerterweise wurde diese Aktivität aufgehoben, wenn PVCs entweder mit mutierten Ad5-Knob-Domänen (Δ491/492 – zuvor wurde gezeigt, dass es die Bindung von Ad5 an Zielzellen reduziert40; Erweiterte Daten Abb. 6e, f) oder einem nicht zielgerichteten DARPin (Anti-Lysozym) ausgestattet wurde DARPin A4 (Proteindatenbank: 5OP1)), was darauf hinweist, dass die PVC-Aktivität in menschlichen Zellen vom Vorhandensein von Schwanzfasern abhängt, die menschliche Zellen richtig binden können. Schließlich fanden wir heraus, dass sich PVCs, die Pvc13-Ad5-knob oder Pvc13-E01-DARPin enthielten, auf der Oberfläche menschlicher Zellen gruppierten (Abb. 2a, unten), was darauf hindeutet, dass die beobachtete Aktivität das Ergebnis einer neuartigen Bindungswechselwirkung zwischen den manipulierten PVCs war und Zielzellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Pvc13 ein tropismusbestimmendes Element des PVC ist und dass dieses Protein modifiziert werden kann, um vorhersehbare Änderungen der Zielspezifität dieses Systems zu bewirken.

a: Die AlphaFold-gesteuerte Entwicklung von Pvc13 (Schwanzfaser) führt zu PVCs, die eine effiziente Abgabeaktivität in menschlichen Zellen aufweisen. Oben wurde die mutmaßliche Zielerkennungsdomäne von Pvc13 (Aminosäuren 403–476) gelöscht (wodurch Pvc13 (verkürzt) erzeugt wurde) und entweder durch die Zielbindungsdomäne des menschlichen Adenovirus 5 (produziert Pvc13–Ad5-knob) oder eine DARPin-spezifische Domäne ersetzt für menschliches EGFR (produziert Pvc13–E01-DARPin). Als Negativkontrollen wurden auch Pvc13-Varianten mit nicht zielgerichteten Bindungsdomänen (Pvc13–Ad5-knob(Δ491/492) und Pvc13–A4-DARPin) einbezogen. Unten wurden PVC-Partikel mit Wildtyp-Toxin-Nutzlasten (WT) oder mit einer neuartigen Nutzlast (Cre) beladen, und die PVC-gesteuerte Proteinabgabe wurde als Zytotoxizität bzw. GFP-Expression gemessen. In der unteren Reihe können neuartige PVC-Designs beobachtet werden, die sich an menschliche Zellen binden (in diesem Fall U2OS zur Erleichterung der Immunfluoreszenz-Bildgebung). Die Bindung von Zielzellen erforderte das Vorhandensein von Pvc13–Ad5-knob oder Pvc13–E01-DARPin; PVCs, die Wildtyp-Pvc13, verkürztes Pvc13 oder ein nicht zielgerichtetes Fusionsprotein enthielten, sammelten sich nicht auf der Zelloberfläche. Maßstabsbalken, 300 μm. b: Auf den Menschen ausgerichtete PVC-Designs können SpCas9-Protein in HEK 293FT-Zellen transportieren und so eine PVC-vermittelte Genbearbeitung in menschlichen Zellen ermöglichen. Die Indel-Bildung erforderte das Vorhandensein einer nicht mutierten Ad5-Knob-Domäne in Pvc13, was darauf hinweist, dass diese Aktivität die Wirkung des PVC erforderte. Die Bedingungen werden im Format PVC (Pvc13-Design) – Nutzlast aufgeführt. c: PVC-Designs, die auf den Menschen abzielen, können ZFDs in HEK 293FT-Zellen liefern und so die Basenbearbeitung in menschlichen Zellen ermöglichen. Eine zielgerichtete G-zu-A-Basensubstitution wurde nur beobachtet, wenn jede ZFD-Hälfte (ZFD-L und ZFD-R) von einem ordnungsgemäß gezielten PVC abgegeben wurde; Nicht zielgerichtete PVCs erzeugten eine vernachlässigbare Aktivität. d, Auf den Menschen ausgerichtete PVC-Designs können Leukämiezellen abtöten (Jurkat). Zytotoxizität wurde nur erzeugt, wenn PVCs auf einen T-Zell-Rezeptor umgelenkt wurden, von dem bekannt ist, dass er von Jurkat-Zellen exprimiert wird (CD4), nicht jedoch, wenn PVCs auf einen myeloischen Rezeptor umgelenkt wurden, der auf Jurkat-Zellen nicht vorkommt (CD11b). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung mit n = 3 biologischen Replikaten; einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test.

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Um das PVC als Werkzeug zur Proteinabgabe weiter zu charakterisieren, haben wir die Ergebnisse von Abb. 2a erweitert, indem wir mehrere nützliche Abgabeanwendungen in menschlichen Zellen etabliert haben. Wir haben zunächst getestet, ob PVCs so umprogrammiert werden können, dass sie Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) laden und abgeben, um die Genbearbeitung in menschlichen Zellen zu bewirken (Abb. 2b). Wir fanden heraus, dass, wenn PVCs, die mit Pvc13-Ad5-Knopf neu ausgerichtet waren, mit Cas9 beladen wurden (unter Verwendung einer ähnlichen Strategie wie in Abb. 1e), die resultierenden Partikel zielgerichtete Insertionen und Deletionen (Indels) in HEK 293FT-Zellen erzeugten, die eine Leit-RNA enthielten. Dieses Experiment ist bemerkenswert, da Cas9 viel größer ist als die von diesem PVC nativ geladenen Nutzlasten (170 kDa für Pdp1-NTD-Cas9 gegenüber 37 kDa für Pdp1 und Pnf), was zeigt, dass PVCs verschiedene Nutzlasten unterschiedlicher Größe liefern können (was ähnliche Schlussfolgerungen von unterstützt). andere Studien3,22). Um eine RNA-freie Genbearbeitung mit PVCs zu erreichen, haben wir als nächstes versucht, Zinkfinger-Desaminasen (ZFDs) zu liefern, ein kürzlich beschriebenes System, das aus Zinkfinger-Domänen besteht, die an gespaltene Desaminasen gebunden sind41. Als mit Pvc13–Ad5-knob neu ausgerichtete PVCs entweder mit dem linken oder rechten Arm eines ZFD geladen wurden, der auf den menschlichen TRAC-Locus (ZFD-L bzw. ZFD-R) abzielte, und HEK 293FT-Zellen gleichzeitig verabreicht wurden, beobachteten wir weiter -Ziel-G-zu-A-Basensubstitution (Abb. 2c und erweiterte Daten Abb. 6g), was darauf hinweist, dass PVCs ZFDs liefern können, um die Basenbearbeitung in menschlichen Zellen zu bewirken. Schließlich haben wir, inspiriert von der endogenen biologischen Funktion von PVCs (gezielte Abtötung durch Abgabe von Toxinen), getestet, ob PVCs zur gezielten Abtötung menschlicher Krebszellen eingesetzt werden können. Wir fanden heraus, dass mit endogenen Toxinen (Pdp1 und Pnf) beladene PVCs in Jurkat-Zellen eine wirksame Zytotoxizität hervorriefen, wenn sie mit einem für einen T-Zell-Rezeptor spezifischen DARPin (CD4; Abb. 2d) erneut angesteuert wurden. Bemerkenswert ist jedoch, dass PVCs, die auf einen myeloischen Rezeptor abzielen, der nicht von Jurkat-Zellen produziert wird (CD11b), zu einem vernachlässigbaren Zelltod führten, was darauf hindeutet, dass PVC-vermittelte Zytotoxizität in menschlichen Krebszellen rezeptorspezifisch ist.

Ein bemerkenswertes Merkmal von Bakteriophagen ist ihre enge Zielspezifität42. Es wird angenommen, dass die Phagenspezifität durch hochentwickelte Bindungswechselwirkungen zwischen Phagenschwanzfasern und Rezeptoren, die von Wirtsbakterien präsentiert werden, verliehen wird27,43. Obwohl dies die Behandlung bakterieller Infektionen mit Phagen zu einer Herausforderung machen kann, ist die Spezifität ein entscheidendes Merkmal moderner zielgerichteter Therapeutika und für die Behandlung von Krebs und genetischen Erkrankungen von entscheidender Bedeutung. Unsere Entdeckung, dass die PVC-Spezifität durch die Schwanzfaser verliehen wird und dass der PVC-Tropismus durch rationale Modifikation dieses Proteins geformt werden kann, lässt vermuten, dass PVCs (ähnlich wie Phagen) auch ein hohes Maß an Zielspezifität aufweisen.

Um die PVC-Zielspezifität zu untersuchen, haben wir zunächst eine Reihe künstlicher, von HEK 293FT abgeleiteter Zelltypen erstellt, die definierte nicht-native Rezeptoren aufweisen, auf die manipulierte PVCs leicht abzielen können (Abb. 3a, b). Der Einfachheit halber haben wir als Rezeptoren eine Gruppe von Antikörpern (scFvs und Nanobodies) ausgewählt, die spezifisch für kommerzielle Epitop-Tags sind. Anschließend haben wir die zugehörige Gruppe von Epitop-Tags in die distale Bindungsdomäne der Schwanzfaser eingefügt (wie in Abb. 2a) und die resultierenden modifizierten PVCs diesen „Zelltypen“ verabreicht, um zu verstehen, wie effektiv PVCs die Zielselektion durchlaufen. Wir fanden heraus, dass mit Epitop-Tags neu ausgerichtete PVCs nur in der Lage waren, Nutzlasten effizient in Zellen zu transportieren, die die geeigneten Bindungspartner für diese Epitop-Tags aufwiesen (Abb. 3b). Dieses Ergebnis zeigt, dass die PVC-Spezifität größtenteils durch die Wechselwirkung zwischen der Schwanzfaser und ihrem Zielrezeptor verliehen wird und dass diese Wechselwirkung so manipuliert werden kann, dass sie die spezifische Erkennung neuer Zelltypen ermöglicht.

a,b, Spezifitätstest für PVCs basierend auf künstlichen Rezeptoren. a, Schema des Experiments. Eine Gruppe von Epitop-Tags wurde in die distale Bindungsdomäne der Schwanzfaser (Aminosäuren 403–476 von Pvc13) eingefügt, und eine Gruppe der zugehörigen Rezeptoren (Anti-Epitop-Tag-Antikörper) wurde auf der Oberfläche von HEK 293FT-Zellen angezeigt. Wie in Abb. 1g und 2a wurde die PVC-Aktivität als GFP-Expression nach Abgabe von Cre an Zellen, die loxP-GFP enthielten, gemessen. b: Nur korrekte Epitop-Antikörper-Paarungen führten zu einer effizienten PVC-vermittelten Abgabe von Cre, was darauf hindeutet, dass die PVC-Aktivität eine spezifische Interaktion zwischen der Schwanzfaser und der Zielzelle erfordert. Maßstabsbalken, 500 μm. c, Spezifitätstest für PVCs basierend auf einem endogenen Rezeptor. Rechts wurden mit Pdp1 und Pnf beladene PVCs erneut auf menschliches EGFR ausgerichtet (mit Pvc13–E01-DARPin, wie in Abb. 2a) und an EGFR+- (A431 und A549) und EGFR−-Zelllinien (Jurkat und 3T3) verabreicht. Zytotoxizität wurde nur in den EGFR+-Zelllinien und nur dann beobachtet, wenn Pvc13 das Anti-EGFR-DARPin enthielt. Bei PVCs, die verkürztes Pvc13 ohne Bindungsdomäne (Aminosäuren 403–476) enthielten, wurde keine Zytotoxizität beobachtet (links). d: Die Präsentation eines Zielrezeptors reicht aus, um Zellen für PVCs zu sensibilisieren. Eine Zelllinie (3T3), die gegen die PVC-Abgabe immun ist (c), wurde mit einem Plasmid transfiziert, das menschliches EGFR enthielt, und wurde EGFR-zielenden PVCs ausgesetzt; Diesmal zeigten die Zellen einen Verlust an Lebensfähigkeit. Die Daten sind Mittelwerte (b,c) oder Mittelwerte ± Standardabweichung (d) mit n = 2 (b,c) oder n = 3 (d) biologischen Replikaten; Zweifaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test. NS, nicht signifikant.

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Als nächstes untersuchten wir die PVC-Spezifität gegenüber EGFR, einem natürlichen Rezeptor, der endogen auf einigen menschlichen Zelltypen vorkommt (Abb. 3c). In diesem Experiment haben wir getestet, ob ein PVC, das so programmiert ist, dass es auf EGFR abzielt, spezifisch auf Zellen abzielt, von denen bekannt ist, dass sie EGFR exprimieren. Wir fanden heraus, dass PVCs, die mit einem Anti-EGFR-DARPin (E01) neu angesteuert und mit Toxinen (Pdp1 und Pnf) beladen wurden, nur in der Lage waren, EGFR+-Zelllinien (A549 und A431) und nicht EGFR−-Zelllinien (Jurkat und 3T3) effizient abzutöten. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Transfektion von EGFR in eine EGFR−-Zelllinie aus dem vorherigen Experiment (3T3) diese Zellen für dieses PVC sensibilisiert (Abb. 3d), was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein eines geeigneten Zielrezeptors ausreicht, um PVC-vermittelt zu ermöglichen Lieferung. Diese Ergebnisse liefern – zusätzlich zum Spezifitätstest mit künstlichen Rezeptoren in Abb. 3a, b – den Beweis, dass PVCs ein hohes Maß an Zielspezifität aufweisen und Nutzlasten nur effizient in Zellen abgeben können, die einen geeigneten Zielrezeptor aufweisen.

Um zu verstehen, ob PVCs letztendlich beim Menschen eingesetzt werden könnten, versuchten wir als nächstes, Proteine ​​in einer lebenden Maus abzugeben. Um PVC-Varianten herzustellen, die auf Mauszellen abzielen, verwendeten wir erneut die AlphaFold-gesteuerte Entwicklung von Pvc13 (Abb. 4a). Wir haben zwei neue Bindungsdomänen gescreent: (1) eine modifizierte Ad5-Knopfdomäne (Ad5-knob(RGD/PK7)), die zuvor verwendet wurde44, um den Wirtsbereich von Ad5 auf Mausgewebe auszudehnen, und (2) einen Nanokörper, der auf einen Mausrezeptor abzielt45 (MHC-Klasse II). Nachdem Pvc13 mit diesen neuen Bindungsdomänen ausgestattet wurde, erzeugten die resultierenden PVCs eine deutlich erhöhte Aktivität in Mauszelllinien und Primärzellen (Abb. 4b). Bemerkenswerterweise beobachteten wir, dass PVCs, die mit Ad5-knob(RGD/PK7) erneut angesprochen wurden, zwar einen breiten Tropismus aufwiesen (wie es bei Ad5-RGD/PK7-Viren der Fall ist44), PVCs, die auf MHC-Klasse-II-Viren abzielten, jedoch eine starke Präferenz für MHC+-Immunzellen zeigten, was einen weiteren Beweis dafür liefert Die PVC-Aktivität hängt von der Anwesenheit eines geeigneten Zielrezeptors ab.

a, AlphaFold-vorhergesagte Strukturen neuartiger Maus-Targeting-Pvc13-Designs (Schwanzfasern). Wir haben die Wildtyp-Bindungsdomäne von Pvc13 durch eine erweiterte Tropismusvariante der Ad5-Bindungsdomäne (Ad5-knob(RGD/PK7)) oder einen Nanobody (Nb) ersetzt, der auf das Maus-MHC-Klasse-II-Protein (MHCII) abzielt. b: Neuartige PVC-Designs, die auf Mäuse abzielen, weisen eine erhöhte Aktivität über Mauszelllinien und Primärzellen hinweg auf. PVCs, denen das Spike-Tip-Protein (Pvc10) fehlt, wurden als Negativkontrollen für beide neuartigen Pvc13-Designs verwendet. c, links, schematische Darstellung der Proteinabgabe im Mausgehirn mit PVCs. Rechts erzeugen PVCs, die mit einem Pvc13-Ad5-Knopf (RGD/PK7) ausgestattet sind, ein tdTomato-Signal im Hippocampus von Ai9-Mäusen (loxP-tdTomato). Die Fluoreszenz ging verloren, als das Spike-Tip-Protein (Pvc10) gelöscht wurde, was bestätigt, dass die beobachtete Aktivität durch das PVC vermittelt wurde. Injektionsstellen werden mit weißen Pfeilen angezeigt. Maßstabsbalken, 500 μm. d, PVCs zielen in vivo auf Neuronen ab. Intrakranielle Injektionen wurden wie in c durchgeführt und Einzelzellextrakte aus behandelten Gehirnen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Das Durchflusszytometrie-Gating-Schema ist in Extended Data Abb. 8a dargestellt. MFI, mittlere Fluoreszenzintensität. e, intrakranielle PVC-Injektionen induzieren keine Migration von Immunzellen in das ZNS. Das Durchflusszytometrie-Gating-Schema ist in Extended Data Abb. 8d dargestellt. f, PVCs sind im Gehirn der Maus vorübergehend. Intakte Partikel können aus behandelten Mäusegehirnen nach 0 oder 1 Tag leicht gereinigt werden, jedoch nicht nach 7 Tagen, was darauf hindeutet, dass PVCs nicht über längere Zeiträume im Gehirngewebe verbleiben. Maßstabsbalken, 500 nm. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte (b) oder Mittelwerte ± Standardabweichung (d,e) mit n = 2 (b) oder n = 3 (d,e) biologischen Replikaten; Zweifaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test (d,e).

Quelldaten

Nachdem wir neuartige PVC-Designs identifiziert hatten, die auf Mauszellen abzielen können, versuchten wir als nächstes, eine Proteinabgabe in vivo zu erreichen. Wir haben Cre in PVCs geladen, die Pvc13–Ad5-knob(RGD/PK7) enthalten, und führten intrakranielle Injektionen mit den resultierenden Partikeln in loxP-tdTomato-Reportermäusen durch. Wir injizierten auch separaten Mäusen ähnliche PVCs ohne Spike-Spitze (Pvc10), ein Protein, das wir für die PVC-vermittelte Abgabe in vitro als notwendig erachteten (Abb. 4b); Wir haben dieses Design als Negativkontrolle für die In-vivo-Experimente gewählt, da Δpvc10-PVCs immer noch intakte Partikel bilden und Nutzlasten laden (Extended Data Abb. 7a–c) und nachweislich weniger unspezifische Aktivität in Makrophagen erzeugen als Δpvc13-PVCs (Extended Data Abb. 7d,e). Nach intrakraniellen Injektionen mit den Pvc13-Ad5-knob(RGD/PK7)-Partikeln beobachteten wir eine Cre-vermittelte tdTomato-Expression im Hippocampus (Abb. 4c), was darauf hinweist, dass die PVCs in vivo aktiv sind. Darüber hinaus extrahierten wir Einzelzellsuspensionen aus behandelten Gehirnen und quantifizierten das tdTomato-Signal in Neuronen und Mikroglia mittels Durchflusszytometrie (Abb. 4d und Extended Data Abb. 8a, b); Wir fanden eine signifikante Anreicherung des tdTomato-Signals in Neuronen (aber nicht in Mikroglia), was darauf hindeutet, dass PVCs, die Pvc13-Ad5-knob(RGD/PK7) beherbergen, in vivo auf Neuronen abzielen können (wir haben dieses Ergebnis in vitro gegen primäre Neuronen bestätigt; Extended Data Abb. 8c). Wir fanden auch heraus, dass die PVC-Behandlung keine signifikante Aktivierung von Immunzellen (Abb. 4e und erweiterte Daten, Abb. 8d), keine Produktion von entzündlichen Zytokinen (erweiterte Daten, Abb. 8e) und keinen Verlust an Körpergewicht (erweiterte Daten, Abb. 8f) hervorrief. oder Zelltoxizität (Extended Data Abb. 8g), was darauf hinweist, dass die PVC-Behandlung während dieses experimentellen Zeitverlaufs weder immunogen noch toxisch war. Schließlich fanden wir auch heraus, dass intakte PVCs bei t = 0 oder 1 Tag, jedoch nicht nach t = 7 Tagen, leicht aus behandelten Gehirnen gereinigt werden konnten (Abb. 4f), was darauf hinweist, dass PVCs im Gehirn vorübergehend sind und nicht über längere Zeiträume bestehen bleiben von Zeit; Dies deutet darauf hin, dass dieses System ideal für Therapien geeignet ist, die vorübergehend oder von kurzer Dauer sein sollen. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass PVCs Proteine ​​in vivo abgeben können, was darauf hindeutet, dass dieses System für den späteren Einsatz als Transportmittel für den menschlichen Gebrauch gut positioniert ist.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass ein eCIS (PVCpnf) ein programmierbares Proteinabgabegerät ist, das sowohl zum Laden nicht-nativer Nutzlasten (Abb. 1e, g) als auch zum Zielen auf neuartige Organismen (Abb. 2a und 4b und erweiterte Daten) modifiziert werden kann Abb. 5, 6, 9 und 10). Unsere Untersuchungen des PVC-Targeting-Elements (pvc13; Schwanzfaser) zeigten außerdem, dass PVCs hochgradig zielspezifisch sind und dass die PVC-Aktivität von der erfolgreichen Bindung der Schwanzfaser an einen Rezeptor auf der Zielzelle abhängt (Abb. 2a, d und). 3b–d und erweiterte Daten Abb. 5d und 6e,f). Schließlich demonstrierten wir die Anwendung von PVCs als Transportmittel in verschiedenen Kontexten, beispielsweise bei der gezielten Abtötung von Krebszellen oder als Vermittler der Genombearbeitung (Abb. 2a–d), und wir zeigten, dass das System in Insektenzellen wie beabsichtigt funktioniert (Abb. 1f, g), menschliche Zellen (Abb. 2 und 3), Primärzellen (Abb. 4b und erweiterte Daten Abb. 8c) und in lebenden Mäusen (Abb. 4c, d und erweiterte Daten Abb. 8b). Zusammengenommen stellt diese Arbeit die Entwicklung einer vielseitigen Klasse programmierbarer Proteinabgabewerkzeuge dar, die sich gut für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen eignen, die von der Biokontrolle bis zur Gentherapie beim Menschen reichen.

Die strukturelle und akzessorische Region von PVCpnf (pvc1-16) und die Nutzlast- und regulatorische Region (Pdp1, Pnf und regulatorische Gene PAU_RS16570-RS24015) wurden de novo (GenScript) synthetisiert und in pAWP78- bzw. pBR322-Grundgerüste kloniert. Alle Manipulationen mit Nutzlast und regulatorischen Plasmiden (pPayload) umfassten eine Standard-PCR-Amplifikation mit Phusion Flash 2x Master Mix (ThermoFisher), einen Zusammenbau mit entweder Gibson Assembly Master Mix (NEB E2611L) oder Golden Gate Assembly mit AarI und T4-DNA-Ligase (ThermoFisher ER1582; ​​NEB). M0202) und Transformation in chemisch kompetente Stbl3-Zellen. PVC-Struktur- und akzessorische Plasmide (pPVC) wurden mit KOD Xtreme Hot Start DNA Polymerase (Sigma-Aldrich 71975) mit mehreren Modifikationen des Herstellerprotokolls amplifiziert: 100 ng Template-DNA, 16 Zyklen und 30 Minuten Verlängerungszeit. Diese Plasmide wurden dann unter Verwendung von Gibson Assembly Master Mix mit 2–4-stündigen Inkubationszeiten bei 50 °C zusammengesetzt und in elektrokompetente EPI300-Zellen (Lucigen EC300110) elektroporiert. Eine Zusammenfassung der während dieser Arbeit erzeugten Plasmide finden Sie in der Ergänzungstabelle 7; Annotierte Plasmidsequenzen finden Sie in den Ergänzungsdaten 1.

Für jede PVC-Bedingung wurde jeweils eine Variante von pPVC und pPayload in EPI300-Zellen elektroporiert und PVC-Partikel wurden unter Verwendung einer modifizierten Version einer zuvor verwendeten Methode9 gereinigt. Die Kolonien wurden in 2 ml Terrific Broth (US Biological T2810) inokuliert und 16 Stunden lang bei 37 °C geschüttelt, bevor sie (im Verhältnis 1:1.000) in 500 ml TB-Medium inokuliert und weitere 24 Stunden lang bei 30 °C geschüttelt wurden. Die Kulturen wurden dann 30 Minuten lang bei 4.000 g zentrifugiert und in 28 ml Lysepuffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5 (ThermoFisher 15567027), 140 mM NaCl (AmericanBio AB01915), 3 mM KCl (Sigma-Aldrich P9541), 5 mM resuspendiert MgCl2 (Sigma-Aldrich M4880), 200 μg ml-1 Lysozym (ThermoFisher 89833), 50 μg ml-1 DNase I (Sigma-Aldrich DN25), 0,5 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich 93443) und 1 × Protease Inhibitor-Cocktail (MedChem Express HY-K0010)) und wurden anschließend 90 Minuten lang bei 37 °C geschüttelt, um die Lyse zu fördern. Anschließend wurden die Lysate 30 Minuten lang bei 4 °C mit 4.000 g pelletiert, um die Zelllysatmenge zu entfernen. Anschließend wurden die Überstände extrahiert und in einer Ultrazentrifuge 2 Stunden lang bei 120.000 g und 4 °C zentrifugiert, um PVC-Proteinkomplexe zu pelletieren. Die Pellets wurden in 1 ml PBS (Life Technologies 10010049) resuspendiert und 15 Minuten lang bei 4 °C und 16.000 g zentrifugiert, um restliches festes Lysat zu entfernen. Die Überstände wurden dann auf 28 ml kaltes PBS aufgetragen, bevor der Ultrazentrifugenschleudergang (120.000 g für 2 Stunden) und der Klärschleudergang (16.000 g für 15 Minuten) noch zweimal wiederholt wurden. Die endgültigen Pellets wurden in 50 µl PBS resuspendiert und die PVC-Ausbeute wurde durch A280-Messung auf einem NanoDrop-Instrument (ThermoFisher) quantifiziert. Für Mausexperimente wurde Lipopolysaccharid dann mithilfe einer auf Detergens basierenden Methode aus den endgültigen PVC-Proben entfernt46; Kurz gesagt, die Proben wurden in 1 ml kaltem PBS verdünnt und 20 µl Triton X-114 (Sigma-Aldrich X-114) hinzugefügt. Die Proben wurden dann 30 Minuten lang bei 4 °C in einem Röhrchenwender inkubiert, 10 Minuten lang auf 37 °C überführt, damit das Detergens aus der Lösung austreten konnte, und 20 Minuten lang bei 20.000 g bei 37 °C geschleudert, um das Protein abzutrennen und Waschmittelphasen. Die obere Phase (die das Protein enthält) wurde extrahiert und der Vorgang noch zweimal wiederholt (d. h. Triton X-114 wurde insgesamt dreimal zugegeben) und die letzte Proteinphase wurde mit 300 mg Bio-Beads SM-2 inkubiert ( Bio-Rad 1523920) bei 4 °C in einem Röhrchenwender über Nacht. Anschließend wurden Proteinproben aus den Perlen extrahiert, durch einen 0,2-μm-Sterilfilter (Pall 4612) geleitet und mit einer abschließenden Ultrazentrifugendrehung auf 50 μl PBS konzentriert. Die Endotoxinspiegel wurden dann mit einem Pierce Chromogenic Endotoxin Quant Kit (ThermoFisher A39552) quantifiziert. Alle PVC-Proben wurden vor der Verwendung maximal 1 Woche lang in PBS bei 4 °C gelagert.

Um festzustellen, ob endogene PVC-Nutzlasten (Pdp1 und Pnf) unabhängig vom PVC-Komplex Zytotoxizität hervorrufen, haben wir jedes dieser Proteine ​​​​isoliert gereinigt. Jede Nutzlast wurde mit einem Affinitäts- und Löslichkeits-Tag (6×His-Strep-SUMO) markiert und in kompetente E. coli BL21 (DE3)-Zellen (Sigma-Aldrich CMC0016) transformiert. Die Kolonien wurden in 5 ml TB-Medium inokuliert und 16 Stunden lang bei 37 °C geschüttelt, bevor sie (im Verhältnis 1:200) in 1 l zusätzliches TB inokuliert wurden. Diese Kulturen wurden dann bei 37 °C geschüttelt, bis sie einen A600 von 0,6–0,8 erreichten, woraufhin sie mit 0,5 mM IPTG (Goldbio I2481C) induziert und weitere 4 Stunden bei 37 °C geschüttelt wurden. Die Kulturen wurden dann 30 Minuten lang bei 4.000 g zentrifugiert und in 50 ml kaltem Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5 (ThermoFisher 15567027), 280 mM NaCl (AmericanBio AB01915), 3 mM KCl (Sigma-Aldrich P9541) resuspendiert mM MgCl2 (Sigma-Aldrich M4880), 1 µl Benzonase (Sigma-Aldrich E1014) pro 50 ml Puffer und 1 Tablette cOmplete (Sigma-Aldrich 11836170001) pro 50 ml Puffer); Die resuspendierten Zellen wurden 30 Minuten lang gerührt, um eine homogene Mischung sicherzustellen, und wurden dann zweimal durch einen Mikrofluidizer M110P von Microfluidics geleitet. Die Lysate wurden dann 30 Minuten lang bei 4 °C mit 9.000 g zentrifugiert und die Überstände wurden auf 2,5 ml einer 50 %igen Aufschlämmung (in Lysepuffer) von Strep-Tactin Superflow Plus-Harz (Qiagen 30004) aufgetragen und 30 Minuten lang bei 4 °C gerührt Mindest. Das Harz wurde dann 3 Minuten lang bei 4 °C mit 2.000 g pelletiert, zweimal mit 40 ml Lysepuffer gewaschen und schließlich auf eine Säule (ThermoFisher 29922) aufgetragen und abtropfen gelassen. Bei verschlossener Säule fügten wir als nächstes 12,5 ml kalten Elutionspuffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5 (ThermoFisher 15567027), 140 mM NaCl (AmericanBio AB01915), 3 mM KCl (Sigma-Aldrich P9541), 5 mM MgCl2 (Sigma) hinzu -Aldrich M4880) und 100 µl SUMO-Protease pro Säule (ein Geschenk von J. Strecker)) und inkubierte die Säule über Nacht bei 4 °C, um das Protein aus dem Harz freizusetzen. Das gereinigte Protein wurde dann unter Verwendung eines 10-kDa-Amicon-Ultra-Filters (Sigma-Aldrich UFC901024) konzentriert, durch A280-Messung auf einem NanoDrop-Instrument (ThermoFisher) quantifiziert und durch SDS-PAGE und anschließende Coomassie-Färbung auf ordnungsgemäße Expression und Reinigung überprüft. Rohe, unbeschnittene Versionen aller Proteingele finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

Um festzustellen, ob ein Protein in PVCs geladen wurde, nutzten wir die Tendenz unseres PVC-Reinigungsverfahrens, Komplexe mit hohem Molekulargewicht gegenüber freien Proteinen bevorzugt zu reinigen (Extended Data, Abb. 3a). Nutzlastproteine ​​(in pPayload geklont) wurden mit C-terminalen HiBiT-Tags markiert und PVC-Partikel, die die markierten Nutzlasten enthielten, wurden gereinigt. Die Grundplatte des PVC (kodiert durch pvc12) wurde ebenfalls mit HiBiT markiert, um als Ladekontrolle für den Western Blot zu dienen. Zwanzig Mikrogramm der resultierenden PVCs (die beladene Nutzlasten enthielten) wurden dann mit NuPAGE LDS-Probenpuffer (ThermoFisher NP0008) und NuPAGE-Probenreduktionsmittel (ThermoFisher NP0009) gemischt, beide auf eine Endkonzentration von 1x, und anschließend bei 95 °C gekocht für 10 Min. Die denaturierten PVC-Nutzlastproben wurden dann 30 Minuten lang auf NuPAGE Bis-Tris 1–12 % Proteingelen (ThermoFisher NP0321) bei 200 V in 1× MOPS-Puffer (ThermoFisher NP000102) laufen gelassen und mit einem iBlot 2-Instrument auf PVDF-Membranen geblottet ( ThermoFisher). Um Nutzlasten mit niedrigem Molekulargewicht zu visualisieren (wie in Extended Data Abb. 3c, d durchgeführt), haben wir stattdessen die denaturierten Proteinproben auf NuPAGE Bis-Tris 12% Proteingelen (ThermoFisher NP0342) in 1 × MES-Puffer (ThermoFisher B0002) laufen lassen. Schließlich wurden die Nutzlastbänder mit dem Nano-Glo HiBiT-Blotsystem (Promega N2410) visualisiert und Bilder mit einem Bio-Rad ChemiDoc-Instrument aufgenommen. Eine repräsentative Aminosäuresequenz eines nicht-nativen Proteins, das über eine PVC-Verpackungsdomäne geladen wird, finden Sie in der Ergänzungstabelle 5.

Eine Liste der in dieser Studie verwendeten Zelllinien finden Sie in der Ergänzungstabelle 8. Zelllinien wurden vor der Verwendung nicht authentifiziert oder auf Mykoplasmen getestet, da sie hauptsächlich aus kommerziellen Quellen bezogen wurden. Sofern nicht anders angegeben, wurden Säugetierzellen in T75-Kolben (ThermoFisher 156499) bei 37 °C mit 5 % CO2 entweder in DMEM-GlutaMAX (ThermoFisher 10569044) oder RPMI-GlutaMAX (ThermoFisher 61870127) gehalten und Insektenzellen wurden vorsichtig in 125-125 °C geschüttelt. ml-Schüttelkolben (Sigma-Aldrich CLS431143) bei 28 °C in ESF921 (VWR 100000-000). Alle Medien wurden mit 10 µg ml−1 Gentamicin (Sigma-Aldrich G1397) und 1× Penicillin-Streptomycin (ThermoFisher 15140122) ergänzt; Säugetiermedien wurden außerdem mit 10 % FBS (VWR 97068-085) ergänzt. Für das Wachstum primärer Splenozyten wurde das Medium außerdem mit Maus-IL-2 (Peprotech 212-12) und 50 µM 2-Mercaptoethanol (ThermoFisher 21985023) ergänzt.

Um die PVC-vermittelte Proteinabgabe in vitro nachzuweisen, wurden Zielzellen in 96-Well-96-Well-Platten mit klarem Boden (VWR 89091-012) ausgesät und bis zu einer Konfluenz von etwa 80 % wachsen gelassen. Anschließend wurden PVCs bis zu einer Endkonzentration von 150 ng µl-1 in 50 µl Zellkulturmedium pro Vertiefung zugegeben. Für Assays, die die Co-Transfektion eines Cre-Reporterplasmids oder eines Guide-RNA-Plasmids beinhalten, wurde die DNA unmittelbar nach der Zugabe von PVCs mit GeneJuice-Transfektionsreagenz (Sigma-Aldrich 70967) für menschliche Zellen oder Insect-GeneJuice-Transfektionsreagenz (Sigma-Aldrich 71259) für Sf9 transfiziert Zellen. Bei Tests, die die Transfektion eines Zielrezeptors beinhalten (z. B. EGFR oder oberflächenpräsentierte Anti-Epitop-Tag-Antikörper in Abb. 3), erfolgte dies 24 Stunden vor der Zugabe von PVCs. Für Toxinabgabeexperimente wurde die Zytotoxizität mithilfe des CellTiter-Glo 2.0 Cell Viability Assay (Promega G9241) und/oder der Färbung mit Lebensfähigkeitsfärbung (8 ng µl−1 FDA (Sigma-Aldrich F7378) + 20 ng µl−1 PI (Sigma-Aldrich F7378) bewertet. Aldrich P4170)) und Bildgebung unter einem Zeiss Observer D1-Mikroskop; Diese Analysen wurden bei t = 24 Stunden für Säugetierzellen und t = 2 Tagen (CellTiter-Glo)/4 Tagen (FDA/PI-Färbung und Bildgebung) für Sf9-Zellen durchgeführt. Für CellTiter-Glo-Assays wurde allen Vertiefungen, die eine höhere Lumineszenz als die Kontrollvertiefung (PBS) aufwiesen, ein Zytotoxizitätswert von 0 % zugewiesen, um negative Zytotoxizität zu vermeiden. Für Assays mit Cre-gesteuerter GFP-Expression wurden die Zellen vier Tage lang inkubiert und dann mit einem konfokalen Leica DMi8-Mikroskop abgebildet und mit Durchflusszytometrie analysiert (siehe „Durchflusszytometrie-Analyse für In-vitro-PVC-Experimente“). Für Gen-Editing-Experimente wurden Zellen 4 Tage lang inkubiert, genomische DNA mit 50 µl QuickExtract DNA Extraction Solution (Lucigen QE09050) extrahiert und Indels oder Basensubstitutionen mit NGS quantifiziert (siehe „Deep Sequencing“). Alle numerischen Daten aus PVC-Experimenten wurden mit Prism (9.3.1) aufgezeichnet und die Abbildungen in Adobe Illustrator (25.2.3) grafisch zusammengestellt.

Um die Struktur neuartiger PVC-Schwanzfaserdesigns vorherzusagen, nutzten wir ColabFold, eine Google Colab-basierte Implementierung von AlphaFold235,36,37. Für alle Schwanzfaserdesigns wurden Sequenzen als Trimer in AlphaFold2_mmseqs2 (v1.2) abgefragt, wobei die Standardeinstellungen für Modell/MSA und num_recycles auf 12 eingestellt waren. Die Läufe wurden von virtuellen Google Cloud-Maschinen mit NVIDIA Tesla A100-GPUs unterstützt. Die resultierenden Strukturen wurden mit PyMOL (2.5.2) visualisiert und neu eingefärbt.

Eine routinemäßige Negativfärbungs-TEM-Analyse gereinigter PVC-Partikel wurde entweder in der Nanotechnology Materials Core Facility des Koch Institute oder im MIT Materials Research Laboratory durchgeführt. Kurz gesagt, 5–10 µl jeder PVC-Probe (verdünnt auf 100–500 ng µl−1) wurden 60 s lang auf ein glimmentladenes 200-Mesh-Kupfer-TEM-Gitter mit Kohlenstoffbeschichtung (VWR 100489-722) aufgetragen, bevor überschüssige Flüssigkeit entfernt wurde mit einem Kimwipe. Anschließend wurden die Gitter zweimal mit 10 µl 2 % Uranylacetat-Färbung behandelt (der erste wurde sofort abgetupft und der zweite nach 30 s) oder fünfmal mit 2 % Uranylformiat-Färbung behandelt (Inkubation unter leichtem Rühren für 5 s, 5 s, 10 s). , 30 s und 30 s) und bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die Gitter wurden dann entweder in einem (1) JEOL 2100 FEG-Mikroskop bei 200 kV, ausgestattet mit einer Gatan 2k × 2k UltraScan CCD-Kamera, oder einem (2) FEI Tecnai (G2 Spirit TWIN) Mikroskop bei 120 kV, ausgestattet mit einer Gatan Orius SC1000B, abgebildet Kamera.

Um festzustellen, ob PVC-Partikel an Zielzellen binden, verwendeten wir eine modifizierte Negativfärbungs-TEM-Methode. A549-Zellen durften mit hoher Dichte an glimmentladenen 200-Mesh-kohlenstoffbeschichteten Gold-TEM-Gittern (VWR 76499-704) in 24-Well-Platten haften, bevor sie einer hohen Dosis PVC-Probe (1,8 µg µl−1 Endkonzentration) ausgesetzt wurden ) für 3 Stunden. Die Zellen wurden dann 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences 1574) fixiert, einmal mit PBS gewaschen, 5x mit 2 % Uranylformiat angefärbt (mit der gleichen Methode wie oben) und bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Die Zellen wurden dann mit einem FEI Tecnai-Mikroskop (G2 Spirit TWIN) bei 120 kV abgebildet, das mit einer Gatan Orius SC1000B-Kamera ausgestattet war.

Die hochauflösende Bildgebung PVC-behandelter menschlicher Zellen wurde mithilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) durchgeführt. A549-Zellen wurden auf 12-mm-Glasdeckgläsern (VWR 354087) in 24-Well-Platten bis zu einer Konfluenz von 80–90 % gezüchtet, bevor sie 3 Stunden lang einer moderaten Dosis PVC-Probe (500 ng µl−1) ausgesetzt wurden. Anschließend wurden die Zellen 1 Stunde lang mit 2,5 % Glutaraldehyd/2 % Paraformaldehyd/100 mM Natriumkakodylat bei 4 °C fixiert, zweimal mit 100 mM Natriumkakodylat (jeweils 5 Minuten bei 4 °C) gespült und mit 1 % Osmiumtetroxid behandelt /Natriumcacodylat für 30 Min. bei 4 °C, 3–4 Mal (jeweils 10 Min.) mit destilliertem Wasser gespült, mit Ethanol dehydriert, 15 Min. mit 50 % TMS/50 % Ethanol behandelt, mit 80 % TMS/20 % behandelt Ethanol für 15 Minuten, zweimal mit 100 % TMS für jeweils 5 Minuten behandelt und an der Luft trocknen gelassen, bevor Sputterbeschichtung und Bildgebung in einem Zeiss Crossbeam 540 SEM/fokussierter Ionenstrahl durchgeführt werden.

Um festzustellen, ob PVC-Partikel an Zielzellen gebunden sind, markierten wir ein externes PVC-Protein (Pvc2) mit einem N-terminalen Flag-Tag und setzten die resultierenden PVC-Partikel (bei 300 ng µl−1) 3 Stunden lang bei 37 °C den Zielzellen aus . Die Zellen wurden dann 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences 1574) fixiert und 1 Stunde lang mit Blockierungspuffer (10 % Ziegenserum (Sigma-Aldrich G9023) und 0,1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich 93443) blockiert. verdünnt in PBS), gefärbt für 1 Stunde mit M2-Anti-Flag-Antikörper (Sigma-Aldrich F1804; verdünnt 1:500 in Blockierungspuffer), gefärbt für 1 Stunde mit einem Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörper (ThermoFisher A11001; verdünnt 1: 1.000 in Blockierungspuffer), 10 Minuten lang mit 1 µg ml−1 DAPI (ThermoFisher D1306; verdünnt in PBS) gefärbt und mit einem konfokalen Leica DMi8-Mikroskop abgebildet. Eine Aminosäuresequenz, die die Position des Flag-Tags auf Pvc2 darstellt, finden Sie in der Ergänzungstabelle 6.

Wir verwendeten auch Immunfluoreszenz, um die Wirkung von PVCs auf das Zytoskelett zu untersuchen (Extended Data Abb. 6a). Zielzellen wurden zunächst in 96-Well-Platten ausgesät und bis zu einer Konfluenz von etwa 80 % wachsen gelassen, bevor sie 24 Stunden lang PVCs (150 ng µl−1 Endkonzentration) ausgesetzt wurden. Die Zellen wurden dann 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, 1 Stunde lang mit Blockierungspuffer blockiert, 1 Stunde lang mit Rhodamin-Phalloidin (ThermoFisher R415; verdünnt auf die 1-fache Endkonzentration in Blockierungspuffer) gefärbt und 10 Minuten lang mit 1 µg gefärbt ml−1 DAPI (ThermoFisher D1306; verdünnt in PBS) und mit einem konfokalen Leica DMi8-Mikroskop abgebildet.

Für Experimente mit PVC-vermittelter Abgabe von Cre haben wir die Abgabeeffizienz mithilfe der Durchflusszytometrie gemessen. Die Zellen wurden zunächst durch Inkubation mit TrypLE Express-Dissoziationsreagenz (ThermoFisher 12604) geerntet, 3 Minuten lang bei 300 g pelletiert und in 100 µl Durchflusszytometriepuffer (PBS, ergänzt mit 2 % EDTA (Life Technologies 15575020) und 5 % FBS (VWR) resuspendiert 97068-085)). Die Proben wurden auf einem Cytoflex S-Durchflusszytometer von Beckman Coulter untersucht und die Analyse wurde mit CytExpert (2.3.1.22) und FlowJo (10.8.2) durchgeführt. Ein repräsentatives Schema für die Gating- und Schwellenwerteinstellung ist in Extended Data Abb. 4c dargestellt.

Um PVC-induzierte genomische Veränderungen in Zielzellen zu erkennen, amplifizierten wir zunächst die Zielregion aus jedem genomischen DNA-Extrakt (siehe „In-vitro-PVC-Abgabeexperimente“) mit NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix (NEB M0541). Die Zielregionen wurden dann mit indizierten Illumina P5- und P7-NGS-Primern strichcodiert. Die Bibliotheken wurden mit einem Qiagen PCR Purification Kit (Qiagen 28104) gereinigt, auf einem NanoDrop-Instrument (ThermoFisher) quantifiziert und auf einem Illumina MiSeq-Instrument (mit einer Leselänge von 300 bp) sequenziert. Indels und Basensubstitutionen wurden dann mit Geneious Prime (2020.0.5) quantifiziert. Für die Tiefensequenzierung verwendete Primer finden Sie in der Ergänzungstabelle 9.

Um die Wirkung regulatorischer Gene auf die PVC-Genexpression zu bewerten, verwendeten wir quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (RT-qPCR). E. coli EPI300-Zellen wurden mit jeweils einer Variante von pPVC und pPayload elektroporiert (wie unter „PVC-Reinigung“ beschrieben) und die Kolonien wurden 16 Stunden lang in 5 ml TB bei 37 °C geschüttelt. Die Kulturen wurden dann 5 Minuten lang bei 4.000 g zentrifugiert, in 750 µl TRI-Reagenz (Zymo R2073) resuspendiert, 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und mechanisch durch Vortexen (1 Minute) mit 250 µl 0,5 mm großen Zirkonoxidkügelchen (Fisher) lysiert NC0450473). Anschließend fügten wir 200 µl Chloroform hinzu, inkubierten 3 Minuten bei Raumtemperatur, zentrifugierten 15 Minuten bei 12.000 g (4 °C) und extrahierten die wässrige Phase für die RNA-Extraktion über ein Zymo Direct-zol RNA Miniprep Kit (Zymo R2073) mit der optionale DNAse-Schritt. Anschließend generierten wir cDNA aus diesen RNA-Massenextrakten unter Verwendung von ProtoScript II Reverse Transcriptase (NEB M0368) und Zufallsprimern (NEB S1330) mit dem Protokoll des Herstellers. Schließlich führten wir eine qPCR der resultierenden cDNAs mit Fast SYBR Green Master Mix (ThermoFisher 4385612) in einem Bio-Rad CFX Opus 384 qPCR-Gerät durch. Delta-Delta-Ct-Werte wurden anhand der Housekeeping-Genlücke A47 berechnet. Für qPCR verwendete Primer finden Sie in der Ergänzungstabelle 10.

PVCs wurden in PBS auf etwa 36 μg µl-1 verdünnt, bevor sie zur massenspektrometrischen Analyse an die Biopolymers and Proteomics Facility des Koch Institute geschickt wurden. Kurz gesagt, Proteine ​​wurden mit 10 mM Dithiothreitol (Sigma-Aldrich 11583786001) 10 Minuten lang bei 95 °C reduziert und dann mit 20 mM Iodacetamid (Sigma-Aldrich I5161) 30 Minuten lang bei 25 °C im Dunkeln alkyliert. Anschließend wurden die Proteine ​​mit Trypsin auf S-Trap-Mikrosäulen (ProtiFi C02-micro-80) gemäß dem Protokoll des Herstellers verdaut. Die tryptischen Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC (Thermo UltiMate 3000) unter Verwendung einer PepMap RSLC C18-Säule und einer 2 μm EASY-Spray-Spitze (ThermoFisher ES903) über einen 90-minütigen Gradienten getrennt, bevor sie mit einer Exploris-Masse einem Nano-Elektrospray unterzogen wurden Spektrometer (Thermo). Die resultierenden kartierten Peptidtreffer finden Sie in den Ergänzungsdaten 2.

Alle Mausexperimente entsprachen den Richtlinien der National Institutes of Health und wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Broad Institute of MIT und Harvard genehmigt wurden. Die Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip für die Behandlung entweder mit Kontroll- oder Versuchsbedingungen ohne Verblindung ausgewählt. Weibliche Ai9-Mäuse (Alter 8–12 Wochen) wurden vom Jackson Laboratory erhalten (Stamm 007909). Alle Mäuse wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und hatten nach Belieben Zugang zu Futter und Wasser. Mäuse wurden mit Isofluran (2–3 %) anästhesiert und auf eine stereotaktische Operation vorbereitet; Das Fell wurde rasiert und die Mäuse wurden in einen stereotaktischen Rahmen (Kopf Instruments) gelegt. Um eine Unterkühlung zu verhindern, wurde den Mäusen ein Heizkissen untergelegt. Isofluran (1–2 %) wurde während der gesamten Operation über einen Nasenkonus verabreicht. Zum Schutz der Augen wurde Augensalbe verwendet. Buprenorphin-SR (1 mg kg−1, subkutan) wurde vor Beginn der Operation verabreicht. Als Lokalanästhetikum wurde Bupivacain (1 mg kg−1) intradermal entlang der Schnittlinie injiziert. Meloxicam (2 mg kg−1) wurde vor der Operation ebenfalls subkutan verabreicht. Die Kopfhaut wurde mit Betadine-Peeling und 70 % Ethanol desinfiziert. Mit einem Skalpell wurde entlang der Mittellinie der Kopfhaut ein Einschnitt vorgenommen. Der freigelegte Schädel wurde gründlich gereinigt und eine Kraniotomie oberhalb des Hippocampus durchgeführt. PVC-Proteine ​​wurden auf den Hippocampus gerichtet (–2,3 AP, 1,25 ML, –3 und –1,5 DV) und unter Verwendung einer 10-µl-Hamilton-Spritze (700 Series Microliter Syringes, Hamilton, Model) langsam unter Druck injiziert (100 nl min−1). 701 N Spritze) und einer Mikrospritzenpumpensteuerung (Micro 4; WPI). Nach der Injektion wurde die Nadel 2 Minuten lang an Ort und Stelle belassen und dann langsam herausgezogen. Insgesamt 1.000 nl (Abb. 4c; 500 nl bei −2,0 DV und 500 nl bei −1,5 DV) bei 7,5 µg µl−1 oder 3.000 nl (Abb. 4d–f und erweiterte Daten Abb. 8b,e,f); Pro Maus wurden 1.500 nl bei −3,0 DV und 1.500 nl bei −1,5 DV bei 1,2 µg µl−1 PVC-Probe injiziert. Nach der Injektion wurde die Haut mit einem einfachen, kontinuierlichen Nahtmuster mit 4-0 Ethilon-Nylonnähten versiegelt. Die Einschnitte wurden mit 0,9 %iger steriler Kochsalzlösung und sterilen Baumwollapplikatoren sauber abgewischt. Die Mäuse wurden postoperativ mit Kochsalzlösung hydriert und in einer temperaturkontrollierten Umgebung gehalten, bis sie sich ambulant erholten. Um die postoperativen Schmerzen zu lindern, wurde Meloxicam (2 mg kg−1) alle 24 Stunden bis zu einem Minimum von 72 Stunden nach der Operation subkutan verabreicht.

Zum Zeitpunkt t = 12 Tage nach der Injektion wurden die Mäuse mit Fatal-Plus in einer Dosis von 90 mg kg−1 tief anästhesiert und transkardial mit 20 ml PBS, gefolgt von 20 ml 4%iger Paraformaldehydlösung, perfundiert. Die Gehirne wurden schnell extrahiert und 24 Stunden lang in 4 %iger Paraformaldehydlösung bei 4 °C gelagert. Anschließend wurden sie in 30 %ige Saccharose in PBS-Lösung überführt und zwei Tage lang ins Gleichgewicht gebracht. Anschließend wurden die Gehirne mittels OCT auf einem Kryostat montiert und koronal geschnitten (50 µm). Die schwimmenden Schnitte wurden in PBS gewaschen und mit Anti-NeuN-Antikörper (Sigma-Aldrich MAB377; 1:500) und Alexa 488-Sekundärantikörper (ThermoFisher A11001; 1:1.000) auf Neuronen gefärbt. Die Abschnitte wurden mit PVA-DABCO auf Objektträger montiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Leica DMi8-Mikroskop mit einem 10-fach- und 20-fach-Luftobjektiv aufgenommen.

Die Tiere wurden nach t = 1, 3 und 7 Tagen mit CO2 tief anästhesiert und mit 20 ml PBS transkardial perfundiert. Gehirne von PVC- oder scheininjizierten Mäusen wurden extrahiert und die Zielhemisphären mit Skalpellen in Stücke geschnitten und mit 50 µg ml−1 Liberase (Sigma-Aldrich 05401119001) bei 37 °C 30 Minuten lang verdaut. Einzelzellsuspensionen wurden durch langsames, wiederholtes Pipettieren erzeugt. Myelin wurde manuell mit Myelin Removal Beads II, Mensch, Maus, Ratte (Miltenyi Biotec 130-096-733) und LS-Säulen (Miltenyi Biotec 130-042-401) entfernt, gefolgt von der Anreicherung neuronaler Zellen mit dem Adult Neuron Isolation Kit (Miltenyi). Biotec 130-126-603) und LS-Säulen. Angereicherte Zellpopulationen wurden mit Cytofix-Fixierungspuffer (BD 554655) 30 Minuten lang bei 4 °C fixiert und vor der Antikörperfärbung für die Durchflusszytometrie mit 1:50 TruStain FcX (Anti-Maus-CD16/32)-Reagenz (BioLegend 101320) blockiert; Antikörper und Verdünnungen finden Sie in der Ergänzungstabelle 12.

Platten mit 96 Vertiefungen wurden einen Tag vor der Isolierung mit 0,05 mg ml-1 Poly-d-Lysin (BD 354210) beschichtet. Eine Dissektionslösung wurde unter Verwendung von HBSS (ThermoFisher 14025092), ergänzt mit 10 mM HEPES (ThermoFisher 15630080), 33 mM D-Glucose (Sigma-Aldrich G8270) und 43 mM Saccharose (Sigma-Aldrich S0389), hergestellt. Zeitlich trächtige weibliche C57BL/6J-Mäuse (im Alter von 12 Wochen) wurden gemäß den Standardarbeitsanweisungen der Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) des Broad Institute of MIT und Harvard getötet. Den Embryonen wurden am Embryonaltag 16,5 Gehirne entnommen und in Dissektionslösung präpariert. Pan-Cortex-Gewebe wurde für die Isolierung von Downstream-Neuronen verwendet. Die Gewebe wurden mit TrypLE Select (ThermoFisher 12563011) 30 Minuten lang verdaut und zweimal in mit Trypsininhibitor (Sigma-Aldrich T9253) und BSA (Sigma-Aldrich A9418) ergänzter Dissektionslösung gewaschen. Eine Einzelzellsuspension wurde durch wiederholtes Verreiben hergestellt und die Zellen wurden in Neurobasal-A-Medium (ThermoFisher 10888022), ergänzt mit B-27 Plus Supplement (ThermoFisher A3582801), kultiviert.

Die Isolierung von ZNS-infiltrierenden myeloischen und T-Zellen wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt48. Kurz gesagt, die Mäuse wurden nach t = 1, 3 und 7 Tagen mit CO2 tief anästhesiert und mit 20 ml PBS transkardial perfundiert. Gehirne von Mäusen, denen PVC oder eine Scheininjektion verabreicht worden war, wurden extrahiert und die Zielhemisphären mit Skalpellen in Stücke geschnitten und mit 50 µg ml-1 Liberase (Sigma-Aldrich 05401119001) 30 Minuten lang bei 37 °C verdaut und anschließend durch 100 µm zerstampft und 70-µm-Zellsiebe (Greiner One-Bio 542000 und 542070). Myelin wurde unter Verwendung eines 30 % kontinuierlichen Percoll-Gradienten (Sigma-Aldrich GE17-0891-01) und einer Dichtezentrifugation bei 2.700 U/min entfernt. Nach der Myelinentfernung wurde eine Einzelzellsuspension von hirninfiltrierenden Immunzellen in PBS hergestellt und vor der Antikörperfärbung für die Durchflusszytometrie mit 1:50 TruStain FcX (Anti-Maus-CD16/32)-Reagenz (BioLegend 101320) blockiert. DAPI-Färbelösung (Miltenyi Biotec 130-111-570) wurde in einer Verdünnung von 1:100 unmittelbar vor der Durchflusszytometrieanalyse zugegeben, um lebende Zellen zu unterscheiden. Interstitielle Flüssigkeit, die die Parenchymzellen des Gehirns umgibt, wurde durch Auswaschen von zerkleinertem Gehirngewebe zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Injektion in PBS und Zentrifugation bei 500 g isoliert. Zytokin-ELISAs für Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6), Interferon-γ (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor (TNF) wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers (Invitrogen 88-7013-22) durchgeführt , 88-7064-22, 88-7314-22 bzw. 88-7324-22) und die Absorption bei 450–570 nm wurde gemessen. Die Zytokinkonzentrationen wurden entsprechend den verdünnten Standards gemäß dem Protokoll des Herstellers berechnet.

Um die Persistenz von PVCs im Gehirn von Mäusen zu untersuchen, wurde interstitielle Flüssigkeit aus Gehirnhomogenaten isoliert. Kurz gesagt, PVC-behandelte Mäuse wurden eingeschläfert und vor der Extraktion vollständig intakter Gehirne wurde eine transkardiale Perfusion mit PBS durchgeführt. Hirngewebe wurde mit sterilen Skalpellen mechanisch dissoziiert und anschließend in Einzelzellsuspensionen homogenisiert. Diese Einzelzellsuspensionen wurden 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert, und die geklärten Überstände wurden in 28 ml PBS verdünnt und 2 Stunden lang bei 4 °C und 120.000 g ultrazentrifugiert, um alle intakten PVC-Proteinkomplexe zu pelletieren. Die Pellets wurden in 50 µl PBS resuspendiert und 15 Minuten lang bei 4 °C mit 16.000 g zentrifugiert, um restliches Homogenat zu entfernen. Abschließend analysierten wir die Resuspensionen mit Negativfärbungs-TEM, um intakte PVC-Komplexe nachzuweisen. siehe „Elektronenmikroskopie“.

Alle statistischen Analysen wurden in Prism (9.3.1) durchgeführt. Quantitative Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung mit n = 2–4 biologischen Replikaten pro Bedingung dargestellt; Die Anzahl der dargestellten Replikate ist in den Legenden der Abbildungen aufgeführt. Sofern nicht anders angegeben, stellen biologische Replikate unabhängige Behandlungen in separaten Kulturvertiefungen oder Mäusen dar. Alle mikroskopischen Aufnahmen, Gele und Blots sind repräsentative Bilder aus mindestens n = 3 unabhängigen Experimenten. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen oder zweifaktoriellen ANOVA berechnet, gefolgt von Bonferroni-Post-hoc-Tests (zur Korrektur mehrerer Vergleiche), wie in den Legenden der Abbildungen angegeben. P-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen; Die Ergebnisse aller statistischen Tests (einschließlich P-Werte) sind in den Quelldaten zusammen mit den zugehörigen Quelldaten für jedes Figurenfeld enthalten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle während dieser Arbeit generierten Plasmide (Ergänzungstabelle 7) sind bei Addgene erhältlich. Sequenzierungs-Reads sind im Sequence Read Archive unter der BioProject-ID PRJNA929529 verfügbar. Unbeschnittene Gel- und Immunblot-Bilder finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1. Quelldaten werden diesem Artikel beigefügt. Alle weiteren Daten sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken DS Yun, M. Bisher, D. Mankus und L. Lytton-Jean für Unterstützung und Schulung im Zusammenhang mit TEM- und SEM-Bildgebung; Y. Zhang für zusätzliche Hinweise zur TEM-Bildgebung; RP Schiavoni für Unterstützung bei der Massenspektrometrie; G. Faure für seine Anleitung zu bioinformatischen Techniken; und allen Mitgliedern des Zhang-Labors für ihre Unterstützung und nützlichen Diskussionen. Mehrere Grafiken in den Abbildungen (Zellen in Abb. 1f, g und 3a; Maus, Gehirn und Neuronen in Abb. 4c; Ultrazentrifuge in Abb. 1a und 3a für erweiterte Daten; Nutzproteine ​​in Abb. 1b und Abb. 3a und 10 für erweiterte Daten ) wurden mit BioRender.com erstellt. JK wird durch ein Graduiertenstipendium des Tan-Yang Center for Autism Research unterstützt, BL wird durch ein Stipendium des National Cancer Institute (1F31CA275339-01) unterstützt und MS wird durch ein Langzeitstipendium des Human Frontier Science Program unterstützt. FZ wird durch ein NIH-Stipendium (2R01HG009761-05) unterstützt; das Howard Hughes Medical Institute; das Poitras Center for Psychiatric Disorders Research am MIT; das Hock E. Tan und K. Lisa Yang Center for Autism Research am MIT; das Yang-Tan Molecular Therapeutics Center am MIT; das K. Lisa Yang Brain-Body Center am MIT; Geschenkspender des Broad Institute Programmable Therapeutics; The Pershing Square Foundation, W. Ackman und N. Oxman; J. und P. Poitras; die BT Charitable Foundation; die Asness Family Foundation; die Familie Phillips; D. Cheng; und R. Metcalfe.

Howard Hughes Medical Institute, Cambridge, MA, USA

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae und Feng Zhang

Broad Institute of MIT und Harvard, Cambridge, MA, USA

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae und Feng Zhang

McGovern Institute for Brain Research am MIT, Cambridge, MA, USA

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae und Feng Zhang

Abteilung für Gehirn- und Kognitionswissenschaft, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae und Feng Zhang

Abteilung für Biotechnik, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Joseph Kreitz, Mirco J. Friedrich, Akash Guru, Blake Lash, Makoto Saito, Rhiannon K. Macrae und Feng Zhang

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JK und FZ konzipierten das Projekt und gestalteten alle Experimente. JK führte alle Experimente im Zusammenhang mit der PVC-Expression, -Charakterisierung und -Technik durch. MJF, AG, BL und JK führten Mausinjektionen und andere mausbezogene Verfahren durch. MJF leistete zusätzliche Unterstützung bei der Planung und Datenanalyse im Zusammenhang mit den Mausexperimenten. FZ und MS leisteten kritische Betreuung und Anleitung bei technischen Verfahren. FZ überwachte diese Forschung und das experimentelle Design mit Unterstützung von RKMJK verfasste das Manuskript unter der Leitung von RKM und FZ und mit Beiträgen aller Autoren.

Korrespondenz mit Feng Zhang.

JK und FZ sind Miterfinder der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 63/310.327, eingereicht vom Broad Institute mit dem Titel „Cell-Type Specific Targeting Contractile Injection System“. FZ ist wissenschaftlicher Berater und Mitbegründer von Editas Medicine, Beam Therapeutics, Pairwise Plants, Arbor Biotechnologies und Aera Therapeutics. FZ ist außerdem wissenschaftlicher Berater für Octant. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature dankt Mark Hurst, Martin Pilhofer und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Arbeitsablauf für die PVC-Produktion in E. coli. Der PVC-Locus wurde de novo synthetisiert und in zwei separate Plasmide kloniert: ein strukturelles/akzessorisches Plasmid (pPVC), das pvc1-16 enthält, und ein Nutzlast-/regulatorisches Plasmid (pPayload), das zu liefernde Nutzlasten (Pdp1/Pnf) zusammen mit mehreren gedachten Genen enthält zur Regulierung der PVC-Genexpression (PAU_RS16570-RS24015). b, Vergleich der PVC-Längenverteilungen aus diesem Manuskript und aus einer früheren Arbeit9. Ein repräsentatives TEM-Bild (mit gelb hervorgehobenen ROIs zur Messung von PVC-Längen) wird ebenfalls angezeigt. Maßstabsbalken, 200 nm. c, HHpred/Pfam-Annotation mutmaßlicher PVC-regulatorischer Gene (PAU_RS16570-RS24015). Mindestens ein Gen (PAU_RS16560) enthält eine vorhergesagte Domäne, von der bekannt ist, dass sie an der Genregulation beteiligt ist (Transkriptionsregulatordomäne vom Typ LysR). d, Massenproteinausbeuten nach der Reinigung (aus 500 ml Bakterienkultur) mit oder ohne PAU_RS16570-RS24015. Wenn diese Gene zusammen mit pvc1-16 einbezogen wurden, wurde eine etwa 100-fache Steigerung der Proteinausbeute beobachtet. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung mit n = 3 biologisch unabhängigen Wiederholungen des Reinigungsverfahrens. e, SDS-PAGE-Gel, das die Ergebnisse der Reinigung mit oder ohne PAU_RS16570-RS24015 darstellt und das Ergebnis aus (d) bestätigt. f, TEM-Bilder, die die Ergebnisse der Reinigung mit oder ohne PAU_RS16570-RS24015 darstellen, was das Ergebnis aus (d) weiter bestätigt und darauf hinweist, dass die resultierenden Partikel mit Nutzlastmangel immer noch eine kanonische Struktur behalten. Maßstabsbalken, 200 nm. g, RT-qPCR-Analyse der PVC-Expression mit oder ohne PAU_RS16570-RS24015. In Zellen ohne PAU_RS16570-RS24015 wurde kein signifikanter Rückgang der mRNA-Spiegel für pvc1-16 beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Gene keine direkte Rolle als Transkriptionsregulatoren für diesen Locus spielen. Die Werte sind Mittelwerte mit n = 3 separaten qPCR-Vertiefungen für jede Bedingung. h, Western Blot gegen eine strukturelle PVC-Komponente (Pvc12) in der ungereinigten Bakterienkultur sowie einer gereinigten Probe. In Bakterien, denen PAU_RS16570-RS24015 fehlt, wurde eine Pvc12-Bande beobachtet, was zeigt, dass diese Gene für die Expression mindestens eines PVC-Strukturproteins nicht notwendig sind. Dies könnte darauf hindeuten, dass PAU_RS16570-RS24015 die Anordnung (und nicht die Expression) von PVC-Partikeln beeinflusst.

Quelldaten

a: PVCs, die Flag-Pvc2 beherbergen, sind in Sf9-Zellen aktiv, was darauf hindeutet, dass die Kontraktion der Hülle (die für die Injektion von Zielzellen7 erforderlich ist) durch das Hinzufügen des Flag-Tags auf Pvc2 wahrscheinlich nicht beeinträchtigt wird. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung mit n = 3 biologischen Replikaten. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test berechnet; ****P < 0,0001; ns, nicht signifikant. b: In der TEM können kontrahierte, mit Flaggen markierte PVCs beobachtet werden, was einen weiteren Beweis dafür liefert, dass diese Markierungsstrategie die Kontraktion der Hülle nicht hemmt. Ein PVC-Partikel, der einen kontrahierten Phänotyp aufweist, ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Maßstabsbalken, 100 nm. c: Die Verbindungsdomäne zwischen den Hüllenuntereinheiten für T6SS (PDB: 3J9G) und PVC (PDB: 6J0B) enthält eine flexible N-terminale Domäne (NTD), die wahrscheinlich das N-terminale Flag-Tagging dieses Proteins ohne Verlust der Hüllenkontraktion ermöglicht . d: Der N-Terminus von Pvc2 liegt nach außen frei, wenn sich das PVC im verlängerten Zustand befindet (PBDs: 6J0B, 6J0C), was die IF-basierte Erkennung von PVC-Partikeln ermöglicht, die Flag-Pvc2 enthalten. Die ersten fünf Reste von Pvc2 sind grün gefärbt, um ihre Position im Hüllenkomplex zu markieren. e, das IF-Signal gegen PVCs, die Flag-Pvc2 (grün) beherbergen, zerfällt nach 24 Stunden, was möglicherweise darauf hindeutet, dass diese IF-Methode selektiv PVCs im erweiterten Zustand anfärbt. Maßstabsbalken, 50 μm.

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a, Arbeitsablauf zur Untersuchung der Nutzlastbelastung in PVCs. Nur vollständig zusammengesetzte PVC-Partikel (zusammen mit allen geladenen Nutzlasten) sind nach der Ultrazentrifugation auf dem Pellet lokalisiert; Freie Proteine ​​mit niedrigem Molekulargewicht bildeten jedoch kein Pellet. Dies ermöglichte die Identifizierung beladener Nutzlasten durch denaturierenden Western Blot der Pelletfraktion. b: Die PVC-Nutzlast Pdp1 enthält eine vorhergesagte N-terminale Verpackungsdomäne. Die N-terminale Domäne (NTD) von Pdp1 ist wahrscheinlich ungeordnet, da sie einen niedrigen pLDDT-Score in AlphaFold (er erscheint als lange ungeordnete Erweiterung in der vorhergesagten Struktur des Proteins) sowie einen hohen PONDR VSL2-Score aufweist49. Diese N-terminale ungeordnete Region könnte als „Verpackungsdomäne“ dienen – ein molekularer Identifikator, der die Lademaschinerie des PVC dabei unterstützt, die richtigen Nutzlasten zu identifizieren und zu laden. cd, N-terminale Verpackungsdomänen von Pdp1 (c) und Pnf (d) sind notwendig und ausreichend für das Laden dieser Proteine ​​in ein PVC-Partikel. Pdp1 und Pnf wurden mit C-terminalen HiBiT-Tags markiert (um die Erkennung per Western Blot zu ermöglichen) und seriell verkürzt, um minimale Sequenzen zu lokalisieren, die diese Nutzlasten in ein PVC-Partikel laden können. Domänen an den N-Termini jedes Nutzproteins reichten für die Beladung aus, und die Verkürzung dieser NTDs inhibierte die Beladung, was darauf hindeutet, dass die NTDs von Pdp1 und Pnf als Verpackungsdomänen für dieses PVC dienen. Wie in Abb. 1e wurde das Grundplattenprotein (Pvc12) als Ladungskontrolle für diesen Western Blot ausgewählt, da in jedem PVC-Partikel eine äquivalente Anzahl von Pvc12-Einheiten gefunden wird. Beachten Sie, dass in Panel (d) zwar sowohl die Pvc12- als auch die Pnf-Bande auf demselben Gel sichtbar gemacht wurden, jedoch zwei unterschiedliche Belichtungszeiten verwendet wurden (um eine Übersättigung der helleren Pvc12-Banden zu vermeiden).

a: Unbeladene PVCs sowie separat gereinigte Nutzlasten (Toxine Pdp1 und Pnf) reichen nicht aus, um eine effiziente Zytotoxizität in Sf9-Zellen zu erzeugen. Pdp1 und Pnf wurden unabhängig von PVC-Komplexen durch Affinitätsreinigung gereinigt und Sf9-Zellen in Dosen verabreicht, die ungefähr der in PVCs geladenen Menge entsprachen (Bestimmung der biologisch relevanten Nutzlastdosen in (b)). Eine wirksame Zytotoxizität wurde nur beobachtet, wenn sowohl der PVC-Komplex als auch die Nutzproteine ​​gemeinsam gereinigt wurden. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung mit n = 3 biologischen Replikaten. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test berechnet; ****P < 0,0001. b, Dosisbestimmung für den Zytotoxizitätstest aus (a). Mit HiBiT-markierten Nutzproteinen beladene PVCs wurden zusammen mit einer Titration eines Kontrollproteins (HiBiT-Kontrollprotein; Promega N3010) durchgeführt; Anschließend wurden die Bandenintensitäten (quantifiziert mit ImageJ) verglichen, um die ungefähre Menge des in PVCs geladenen Nutzproteins zu bestimmen. Anhand dieser Analyse haben wir beobachtet, dass Pdp1 in höheren Mengen geladen ist als Pnf (~1 % bzw. ~0,1 % des Gesamtproteins); Daher dosierten wir Sf9-Zellen in (a) mit gereinigtem Pdp1- und Pnf-Protein in einer Menge von 1 % und 0,1 % der Dosis der beladenen PVCs. c, Repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse der PVC-vermittelten Proteinabgabe in kultivierten Zellen. Nachdem wir die Zellen auf FFC/SSC behandelt hatten, um Trümmer zu entfernen, legten wir unter Verwendung einer Positivkontrollbedingung (Zellen, die sowohl mit loxP-GFP als auch mit Cre transfiziert wurden) einen GFP-/+-Schwellenwert fest. Anschließend haben wir diesen Schwellenwert auf experimentelle Daten angewendet, um den Anteil der Zellen zu bestimmen, die GFP exprimieren.

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a, Domänenorganisation des PVC-Schwanzfaser-Gens (pvc13). Die Schwanzfaser enthält eine N-terminale Domäne (NTD) mit Homologie zu Schwanzfasern anderer CISs, eine Domäne, die auf Schaftdomänen adenoviraler Fasern abgebildet ist, und eine C-terminale Domäne mit Homologie zu den Wirtsbindungsdomänen von Bakteriophagen-Schwanzfasern . Die Domänen wurden auf der Grundlage statistisch signifikanter HHpred-Treffer (>95 %) dargestellt und sind grob maßstabsgetreu dargestellt. Maßstabsleiste, 100 AA. b: Pvc13 wird über die NTD geladen, was die C-terminale Phagenfaserspitzendomäne als Zellbindungsdomäne impliziert. Pvc13 war an beiden Enden verkürzt und die Beladung wurde durch denaturierenden Western Blot auf gereinigten PVC-Partikeln bestimmt. Nur die Verkürzung der NTD führte zu einem Verlust von Pvc13, was darauf hindeutet, dass diese Domäne die Schwanzfaser mit dem PVC verbindet. Ein zusätzlicher Blot gegen die Nutzlast (Pdp1-NTD-Cre) wurde hinzugefügt, um das Vorhandensein zusammengesetzter PVCs zu bestätigen. c: Die C-terminale Phagenfaserspitzendomäne von Pvc13 weist Struktur- und Sequenzähnlichkeit mit bekannten Rezeptorbindungsdomänen von Bakteriophagen auf. Strukturelle Überlagerungen wurden zwischen der Phagenfaserspitzendomäne von Pvc13 (in Grau) und analogen Regionen einer Prophagenschwanzfaser in Bizionia argentinensis (Cyan; PDB: 6OV6), gp10 von Phagen T4 (Magenta; PDB: 5IV5) und gp12 von Phagen erzeugt T4 (gelb; PDB: 5HX2). d, Vorhergesagte Strukturen und Abgabeeigenschaften von Wildtyp- und technischen PVC-Schwanzfasern. Die von AlphaFold vorhergesagte Struktur der C-terminalen Phagenfaserspitzendomäne enthält eine helikale Röhrenstruktur mit einer kugelförmigen Spitze an einem Ende, von der wir annahmen, dass sie die distale Zielerkennungsdomäne der gesamten Schwanzfaser ist. Wichtig ist, dass es auch eine kurze 32-AA-Region (mit CTD gekennzeichnet; in Gold dargestellt) gibt, die sich durch die Röhre zurückzieht und diese wahrscheinlich stabilisiert. Wir beobachteten, dass Designs, denen dieses CTD fehlte (bei gemeinsamer Reinigung mit dem PVC-Komplex), in Cre-Abgabeexperimenten in HEK 293FT zu irreführender Aktivität führten, möglicherweise als Folge des sporadischen Ausstoßes der Cre-Nutzlast aus dem PVC-Partikel (freies Cre-Protein kann in Zellen eindringen). unabhängig von einem Lieferfahrzeug50). Allerdings erzeugten Konstruktionen, die diese CTD beibehielten, in HEK 293FT kein abweichendes Signal, was darauf hindeutet, dass der Nutzlastauswurf wieder ordnungsgemäß reguliert wurde. Aminosäuresequenzen für repräsentative Pvc13-Designs finden Sie in den Ergänzungstabellen 1–4. Maßstabsbalken, 150 μm.

a: A549-Zellen zeigen eine F-Actin-Kondensation, nachdem sie EGFR-spezifischen PVCs (die Pvc13–E01-DARPin enthalten) ausgesetzt wurden, was darauf hindeutet, dass die endogenen PVC-Toxin-Nutzlasten (von denen bekannt ist, dass sie auf das Aktin-Zytoskelett24 abzielen) erfolgreich abgegeben wurden. Maßstabsbalken, 100 μm (obere Reihe) und 20 μm (untere Reihe). b, REM-Bilder von A549-Zellen, die mit den gleichen PVC-Designs wie in (a) behandelt wurden. Maßstabsbalken, 100 μm (obere Reihe) und 20 μm (untere Reihe). c, EGFR-spezifische PVCs können direkt sichtbar gemacht werden, indem sie an A549-Zellen binden. Maßstabsbalken, 1 μm (linke Felder) und 100 nm (rechte Felder). d: Auf der Zelloberfläche sind kontrahierte PVCs sichtbar, was darauf hindeutet, dass die PVC-vermittelte Proteinabgabe in menschlichen Zellen durch die Kontraktion der Hülle vermittelt wird. Maßstabsbalken, 100 nm. e, Orte zusätzlicher nichtbindender Mutationen innerhalb der von AlphaFold vorhergesagten Struktur des Pvc13-Ad5-Knobs. Wir untersuchten zwei weitere Mutanten – S408E und L485K –, die jeweils einzelne Aminosäuresubstitutionen enthielten, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie die Bindung von Ad5 an Zielzellen hemmen51. f: Neue Ad5-Knob-Mutanten sind nicht in der Lage, PVCs erneut auf HEK 293FT-Zellen auszurichten. Mit Pvc13-Ad5-Knopf (S408E oder L485K) ausgestattete PVCs wurden mit Cre beladen und HEK 293FT-Zellen verabreicht, die ein loxP-GFP-Plasmid enthielten (wie in Abb. 2a); Nur PVCs, die mit Schwanzfasern ausgestattet waren, die Wildtyp-Ad5-Knopfdomänen enthielten, erzeugten eine effiziente GFP-Expression. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung mit n = 3 biologischen Replikaten. Maßstabsbalken, 150 μm. g, Titration von PVCs, die Pvc13–Ad5-knob beherbergen, über HEK 293FT-Zellen. Die Zellen wurden einer Verdünnungsreihe von Pvc13-Ad5-Knob-Partikeln ausgesetzt, die entweder mit ZFD-L oder ZFD-R beladen waren (die gleichen Partikel wie in Abb. 2c), und die PVC-vermittelte Basensubstitution wurde mit Tiefensequenzierung gemessen. Die PVC-Effizienz liegt bei etwa 1.000 ng/µL. Die Werte sind Mittelwerte mit n = 2 biologischen Replikaten.

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a, PVCs, die deletiertes pvc13 (wie in Abb. 1f, g verwendet), verkürztes pvc13 (ohne aa 403–476, die in Abb. 2a gekennzeichnete Bindungsdomäne) oder deletiertes pvc10 (wie in Abb. 4b – e verwendet) enthalten ) bilden alle unter TEM immer noch intakte Partikel, was darauf hindeutet, dass diese Gene für den Aufbau des PVC-Komplexes nicht notwendig sind. Maßstabsbalken, 100 nm. b: Modifikationen an pvc13 oder pvc10 haben keinen Einfluss auf die Beladung mit Nutzproteinen. Die endogenen PVC-Nutzlasten Pdp1 und Pnf wurden mit HiBiT markiert und entweder in Wildtyp- oder mutierte PVC-Komplexe geladen; Das erfolgreiche Laden der Nutzlast wurde mit einem HiBiT-Blot bewertet. In den mutierten PVCs wurde kein signifikanter Abbau von Pdp1 oder Pnf beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Gene für das Laden der Nutzlast nicht erforderlich sind. c: Die PVC-Längenregulierung wird durch Änderungen an PVC13 oder PVC10 nicht gestört. PVC-Längen wurden mit einer ähnlichen Technik wie in Extended Data Abb. 1b gemessen; Bei den mutierten PVCs wurde keine signifikante Änderung der Längenverteilung beobachtet. d, PVCs binden an Mausmakrophagen in Abwesenheit von Wildtyp-pvc13 oder pvc10. J774A.1-Zellen (eine Zelllinie, die in früheren Studien zur PVC-Aktivität verwendet wurde1,2,3) wurden mit Flag markierten PVCs ausgesetzt (wie in Abb. 1d) und die Bindung wurde mittels Immunfluoreszenz bewertet. PVCs, die modifiziertes Pvc13 enthielten, gruppierten sich immer noch auf der Oberfläche von J774A.1-Zellen, was darauf hindeutet, dass diese Bindungswechselwirkung nicht auf die gleiche Weise durch Pvc13 vermittelt wurde wie bei menschlichen Zellen in Abb. 2a. Maßstabsbalken, 100 μm. e, die PVC-Aktivität in Mausmakrophagen bleibt in Abwesenheit von Wildtyp-pvc13 bestehen. Zur Unterstützung der Ergebnisse aus (d) erzeugten PVCs, die verkürztes oder deletiertes pvc13 enthielten, eine wirksame Zytotoxizität in J774A.1-Zellen, was darauf hindeutet, dass die PVC-Aktivität in dieser Zelllinie nicht das Ergebnis einer spezifischen Erkennung durch die Schwanzfaser ist. Das Entfernen der Spike-Spitze (pvc10) führt jedoch zu einem Aktivitätsverlust, was darauf hindeutet, dass das PVC dennoch unspezifisch gegen diese Zellen aktiv sein könnte. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung mit n = 3 biologischen Replikaten. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test berechnet; ****P < 0,0001; ns, nicht signifikant.

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a, Durchflusszytometrie-Gating-Schema für den In-vivo-tdTomato-Assay in Abb. 4d. b, Zeitverlauf des PVC-induzierten tdTomato-Signals im Gehirn der Maus nach intrakranieller Injektion von PVCs (wie in Abb. 4d). Das TdTomato-Signal in Neuronen begann t = 3–7 Tage nach der Injektion anzusteigen. c: PVCs können in vitro auf primäre Neuronen abzielen. Es wurde ein nahezu vollständiger Zelltod (97 %) beobachtet, was darauf hindeutet, dass PVCs, die mit Ad5-Knopf (RGD/PK7) ausgestattet sind, in vitro einen robusten Tropismus für Neuronen aufweisen. d, Durchflusszytometrie-Gating-Schema zur Quantifizierung aktivierter T-Zellen und Granulozyten in den Immunogenitätstests aus Abb. 4e. e, Quantifizierung entzündlicher Zytokine im ZNS nach intrakranieller Injektion von PVCs mit ELISA. Es wurde keine signifikante Anreicherung eines getesteten Zytokins beobachtet (bei t = 1, 3 oder 7 Tage), was darauf hindeutet, dass die PVC-Injektion keine lokale Entzündungsreaktion im ZNS über dem Hintergrund stimuliert. f, Zeitverlauf des Tiergewichts nach PVC-Injektion. Es wurde kein signifikanter Verlust des Körpergewichts beobachtet, was darauf hindeutet, dass die PVC-Injektion bei diesen Tieren wahrscheinlich keine signifikante systemische Toxizität hervorruft. g, Untersuchung der unspezifischen Zytotoxizität in primären Neuronen in vitro. Mit Cre beladene PVCs (im Gegensatz zu denen in (c), die Toxine enthielten) wurden kultivierten primären Neuronen zugesetzt und bei t = 24 Stunden auf Zelltod getestet. Über dem Hintergrund wurde kein signifikanter Zelltod beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Partikel in Abwesenheit einer Toxin-Nutzlast keine Zelltoxizität hervorrufen. Alle Werte (b, c, e–g) sind Mittelwerte ± Standardabweichung mit n = 3 (b, e–g) oder n = 4 (c) biologischen Replikaten. Die statistische Signifikanz wurde entweder mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA (c,g) oder einer zweifaktoriellen ANOVA (b,e) mit Bonferroni-Post-hoc-Test berechnet; ****P < 0,0001; ns, nicht signifikant.

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a, P. luminescens TT01 enthält eine Reihe von vier PVC-Loci hintereinander auf dem Genom, wobei auf jede strukturelle/akzessorische Region (blau) unmittelbar vermeintliche Nutzlastgene (rot) folgen. b, DNA-Sequenzausrichtung der vier PVC-Loci im P. luminescens TT01-PVC-Array. Die Loci weisen eine erhebliche Sequenzhomologie auf, weichen jedoch am Zielerkennungsgen (pvc13) und in der Nutzlastregion voneinander ab. Dies deutet darauf hin, dass diese PVCs eine gemeinsame Kernstruktur haben, aber auf unterschiedliche Organismen abzielen und jedem Ziel unterschiedliche Nutzlasten zuführen. Die prozentuale Identität wird mit einem Schiebefenster von n = 50 bp dargestellt. c, HHpred-vorhergesagte Domänenorganisation von zwei mutmaßlichen Nutzlastgenen, die von separaten PVC-Loci im P. luminescens TT01-PVC-Array gemeinsam genutzt werden. Während beide Gene eine gemeinsame Domäne haben (YenB/RHS2-assoziiertes Toxin; E = 0,0000067/0,0000039), enthalten beide auch unbekannte Sequenzen an den N-Termini. Angesichts der Tatsache, dass die PVCpnf-Nutzlasten Pdp1 und Pnf über N-terminale Verpackungsdomänen geladen werden (Extended Data Abb. 3b – d), ist es wahrscheinlich, dass diese N-terminalen Domänen Verpackungsdomänen darstellen, die diese Proteine ​​in PVC-Komplexe laden. d, Aminosäuresequenz-Alignment mutmaßlicher Nutzproteine ​​aus (c). Die beiden Nutzlasten weisen in der funktionellen Domäne (YenB/RHS2-assoziiertes Toxin) eine signifikante Sequenzhomologie auf, weichen jedoch an den N-Termini voneinander ab. Es ist plausibel, dass diese beiden Nutzlasten innerhalb von P. luminescens TT01 über ihre divergenten N-terminalen Verpackungsdomänen in verschiedene PVC-Partikel „sortiert“ werden. Die prozentuale Identität wird mit einem Schiebefenster von n = 5 aa dargestellt. e, Vorgeschlagenes Modell für die multiplexierte Proteinabgabe durch P. luminescens TT01. Dieser Organismus produziert wahrscheinlich vier verschiedene PVC-Partikel mit jeweils unterschiedlicher Nutzlast (über eindeutige Verpackungsdomänen in die einzelnen Partikel sortiert) und einem unterschiedlichen Zielapparat (pvc13), die abgesondert werden könnten, um eine unterschiedliche biologische Aktivität in mehreren Wirtsorganismen (oder Zelltypen) zu bewirken /Gewebe) gleichzeitig.

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass PVCs so konstruiert werden können, dass sie 1.) verschiedene neuartige Nutzlasten laden und abgeben und so die Einführung neuartiger biologischer Aktivität in Zielzellen ermöglichen, und 2.) auf neuartige Organismen abzielen und so die Abgabe menschlicher und lebender Zellen ermöglichen Mäuse mit hoher Effizienz und Spezifität. Wir kommen zu dem Schluss, dass PVCs eine neue Klasse hochprogrammierbarer Proteinabgabegeräte darstellen.

Ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Tabellen 1–12.

Annotierte Sequenzdateien für die in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführten Plasmide.

Massenspektrometrische Analyse einer gereinigten PVC-Probe.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kreitz, J., Friedrich, MJ, Guru, A. et al. Programmierbare Proteinabgabe mit einem bakteriellen kontraktilen Injektionssystem. Natur 616, 357–364 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7

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Eingegangen: 06. Oktober 2022

Angenommen: 21. Februar 2023

Veröffentlicht: 29. März 2023

Ausgabedatum: 13. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7

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Nature Reviews Arzneimittelforschung (2023)

Nature Reviews Mikrobiologie (2023)

Natur (2023)

Naturbiomedizinische Technik (2023)

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